本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用。本发明专利技术筛选获得一株高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，并获得了一种鼠单克隆抗体m12。所述单克隆抗体m12与结构蛋白VP2特异性反应，对A型谱系代表毒株具有广谱反应性，而不和O型谱系代表毒株反应。利用鼠单克隆抗体m12和A型结构蛋白兔抗血清建立A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒，相较于现有抗体，具有更好的灵敏度和特异性，适用于A型口蹄疫感染或灭活疫苗免疫后结构蛋白抗体的检测，同时，也是一种监测口蹄疫非免疫地区感染情况的新方法。情况的新方法。情况的新方法。
【技术实现步骤摘要】
一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体m12、制备方法及应用。
技术介绍
[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒(Foot
‑
and
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mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的传染病。FMDV属于微核糖核酸病毒科(picornaviridae)口蹄疫病毒属(aphthavirus)的成员，目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非口蹄疫病毒1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。
[0003]由于同一血清型内不同亚型的抗原性均有不同程度的差别，血清学交叉反应的程度也各有不同，使得口蹄疫的诊断和控制存在很大的难度。单克隆抗体具有识别单一抗原位点的能力，与抗原结合特异性强，均质性高，生物活性单一，易于标准化，可批量生产的特点，广泛应用于生物医学领域中。目前，中国主要流行O型、Asial型和A型FMD，而随着A型FMD的流行，研发A型口蹄疫病毒单克隆抗体对于该病的诊断和预防具有重要意义。
[0004]目前关于口蹄疫血清学检测方法有3种：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB
‑
ELISA)、固相竞争ELISA(SPC
‑
ELISA)，固相竞争ELISA方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特异性更好，操作更为简单，2004年被OIE确立为口蹄疫血清学调查的最新推荐方法。但是，由于FMDV抗原结构复杂，开发广谱且特异性针对A型口蹄疫病毒抗体检测试剂盒，需要筛选到识别型内保守表位的特异性单克隆抗体，但目前针对A型口蹄疫病毒检测的特异性单克隆抗体稀少，这给建立广谱且特异性的A型FMDV抗体检测方法带来一定障碍。
技术实现思路
[0005]针对上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的抗体、制备方法及应用，具体包括以下内容：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，所述单克隆抗体m12重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]优选地，所述单克隆抗体m12为IgG2b型单克隆抗体。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种编码上述第一方面所述单克隆抗体m12的基因片段，编码所述单克隆抗体m12重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m12轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]第三方面，本专利技术提供了一种含有上述第二方面所述的基因片段的表达载体。
[0010]第四方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有上述第二方面所述的基因片段。
[0011]第五方面，本专利技术提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
[0012](i)上述第一方面所述的单克隆抗体m12；
[0013](ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
[0014]第六方面，本专利技术提供了一种上述第一方面所述的单克隆抗体m12在制备检测A型口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。
[0015]第七方面，本专利技术提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括上述第一方面所述的单克隆抗体m12。
[0016]优选地，所述试剂盒包括酶标板、A型口蹄疫病毒灭活抗原、单克隆抗体m12、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。
[0017]优选地，所述酶标板包被有A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清及A型口蹄疫病毒灭活抗原。
[0018]优选地，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清。
[0019]优选地，所述A型口蹄疫结构蛋白兔抗血清的浓度为1:3200。
[0020]优选地，所述A型口蹄疫病毒灭活抗原的包被浓度为1:8。
[0021]优选地，所述单克隆抗体m12的工作浓度为1:4000。
[0022]第八方面，本专利技术提供了一种A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测方法，所述方法包括以下步骤：
[0023]用A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清包被酶标板；将A型口蹄疫灭活抗原加入酶标板中孵育；
[0024]加入待检血清，以及上述第一方面所述的单克隆抗体m12，孵育；
[0025]加入山羊抗小鼠二抗，孵育，后加入TMB，避光显色，然后加入H2SO4溶液终止反应，用酶标仪读取OD
450
；
[0026]计算抑制百分率PI，以40％的PI为临界值，若被检血清PI≥40％，则为阳性；若被检血清<40％，则为阴性。
[0027]优选地，所述方法为：
[0028](1)使用pH＝9.6的Na2CO3/NaHCO3包被液1:3200稀释A型口蹄疫病毒结构蛋白兔抗血清，包被酶标板，4℃过夜；
[0029](2)使用PBST洗板并拍干，使用PBST1:8稀释A型口蹄疫病毒灭活抗原，并加入步骤(1)所述酶标板中，37℃孵育1h；
[0030](3)使用PBST洗板并拍干，使用PBST稀释待检血清，然后加入PBST 1:4000稀释的上述第一方面所述的单克隆抗体m12，震荡混匀，37℃孵育1h；
[0031](4)使用PBST洗板并拍干，加入山羊抗小鼠二抗，37℃孵育1h；
[0032](5)使用PBST洗板并拍干，加入TMB，37℃避光显色15min，加入2M H2SO4溶液终止反应，用酶标仪读取OD
450
；
[0033](6)计算抑制百分率PI，当待检血清PI≥40％，待检血清为阳性，当待检血清<40％，待检血清为阴性。
[0034]本专利技术的有益效果是：
①
本专利技术提供了一种抗A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，所述单克隆抗体m12为IgG2b型单克隆抗体；
②
免疫印迹试验表明其特异性的和
结构蛋白VP2反应；
③
而且所述单克隆抗体m12不与O型谱系代表毒株(O/ZK/93、O/Mya/98和O/HK/93)反应，能广谱特异性的与A型谱系代表毒株(A/GDMM/2013、A/WH/CHA/09和A/AF72)反应，能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断；
④
本专利技术利用所述单克隆抗体m12和A型口蹄疫结构蛋白兔抗血清建立了A型口蹄疫病毒结构蛋白固相竞争ELISA检测试剂盒及检测方法，相较于现有抗体检测方法，本专利技术所述方法具有更好的灵敏度和特异性，适用于A型本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种A型口蹄疫病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体m12，其特征在于，所述单克隆抗体m12重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种编码权利要求1所述单克隆抗体m12的基因片段，其特征在于，编码所述单克隆抗体m12重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述单克隆抗体m12轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的基因片段。4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的基因片段。5.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：(i)如权利要求1所述的单克隆抗体m12；(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。6.如权利要求1所述的单克隆抗体m12在制备检测A型口蹄疫病毒的试剂，或试纸条，或试剂盒中的应用。7.一...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨洋，茹毅，秦晓东，张伟，杨帆，曹伟军，朱紫祥，卢炳州，赵东梅，任蕊芳，吴秀萍，郝荣增，刘华南，李亚军，吴国华，李丹，田宏，张克山，毛箬青，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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