一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失减毒株及由该毒株制备的活疫苗，尤其是公开了一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，缺失I73R全部基因功能的非洲猪瘟病毒减毒株，本发明专利技术还进一步提供了利用该减毒株制备的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗，可保护易感猪免受ASFV强毒自然感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。下一步计划在此基础上再联合缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其使用的安全性。用的安全性。用的安全性。

【技术实现步骤摘要】
一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒构建及其作为疫苗的应用
专利

[0001]本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失减毒株及由该毒株制备的活疫苗，尤其是公开了一种含I73R基因缺失的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，缺失I73R基因功能的非洲猪瘟病毒减毒株，本专利技术还进一步提供了利用该减毒株制备的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗，属于兽用生物制品


技术介绍

[0002]非洲猪瘟(ASF)是非洲猪瘟病毒(African swine fever,ASFV)感染引起的一种高度接触传染致死性传染病，对于家猪的致死率高达100％，目前尚未有商品化用于防治该病的有效疫苗，针对非洲猪瘟的防控，目前主要采取扑杀和拔牙清除等措施。非洲猪瘟最初于1921年在肯尼亚首次爆发，随后迅速在家猪和野猪中流行。自20世纪50年代进入欧洲，整个欧洲地区用了40年的时间才真正清除该病。然而，非洲猪瘟在2007年再次由东非国家传入格鲁吉亚，并于2018年8月传入中国，仅一年的时间，全国30多个省市自治区均发现并报道爆发非洲猪瘟疫情，生猪产量下降40％，给中国民生造成巨大的影响，成为威胁我国养猪业的头号疫病。基于我国现阶段养猪业遭受重创的基本国情，疫苗免疫是作为防控非洲猪瘟疫情最经济有效的方法。自非洲猪瘟发现100多年以来，各种疫苗研制策略，包括灭活疫苗、传代致弱疫苗或天然弱毒苗、亚单位疫苗、新型佐剂以及载体疫苗等保守疫苗研制方案均在非洲猪瘟的防控上做过尝试，但收效甚微。只有基于活病毒采用基因缺失的手段制备的非洲猪瘟病毒基因缺失重组疫苗才是防控非洲猪瘟最经济，最有效的手段。
[0003]ASFV基因组庞大，编码150～170左右个基因，基因排列紧密，双向读码，具有复杂的免疫逃逸机制。目前报道的ASFV毒力基因只要包括：CD2v、DP148R、DP71L、I177L、9GL、UK以及MGF360、MGF110、MGF505等多基因家族，但基于以上毒力基因得到的单基因缺失或多基因缺失得到的重组病毒疫苗候选株或多或少都存在一些安全性、保护效力或毒力残留等问题，对我国目前养猪业的现状以及长远的生物安全防控来看，存在着巨大的挑战。例如，基于中国流行的基因II型病毒进行CD2v或DP148R缺失，减毒效果极其有限；基于MGF360、MGF505、MGF110家族基因的单基因缺失或多基因联合缺失，虽然能够显著降低病毒的毒力，但病毒基因组稳定性会受到影响，存在基因重排的风险，致使田间使用过程中毒力反强风险大大增加，并且田间实验发现基于MGF360和MGF505家族基因的人工缺失疫苗使用后可引起慢性病变，如皮肤溃烂、发热或关节肿胀等不良反应；基于DP71L、9GL、UK或DP96R等缺失构建的减毒重组病毒，免疫动物后出现一过性发热的副反应以及免疫病毒无法被猪体完全清除等问题。另外，在ASFV减毒缺失疫苗的制备过程中，鉴定和阐明基因功能，对靶基因的选择也是至关重要的，往往既要考虑免疫的安全性，又要兼顾足够的保护性能，达到安全性和有效性的平衡。

技术实现思路

[0004]申请人通过多年的研究发现，I73R是一个ASFV编码的早期高表达的非结构蛋白，
序列保守，且定位于细胞核中，参与调控宿主基因的转录和宿主蛋白的表达，本专利技术首先发现ASFV I73R能够抑制宿主抗病毒蛋白Viperin的表达，而后又通过同源重组的方法缺失I73R基因，从而获得一株具有足够安全性和免疫原性的非洲猪瘟病毒株，可作为制备非洲猪瘟疫苗的候选病毒株，并对未来非洲猪瘟疫苗的研制提供了理论依据和实践参考。
[0005]本专利技术提供了一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株及其活疫苗，即缺失了I73R全部基因功能的非洲猪瘟活病毒，I73R基因全部缺失后即表现良好的免疫保护作用，可保护易感猪免受ASFV强毒自然感染或人为攻毒，可用于非洲猪瘟的预防。在此基础上再联合缺失其他致病基因片段或全基因可进一步提高其使用的安全性。
[0006]本专利技术公开的一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株，所述缺失I73R基因的基因序列如下所示：
[0007]ATGGAGACTCAGAAGTTGATTTCCATGGTTAAGGAAGCCTTAGAAAAATATCAATACCCTCTTACTGCTAAAAATATTAAAGTAGTGATACAAAAAGAGCACAATGTCGTCTTACCTACAGGATCTATAAATAGCATACTGTACAGTAACTCAGAACTTTTTGAGAAGATTGATAAGACAAATACCATTTATCCCCCGCTTTGGATACGGAAAAACTAA；
[0008]其中，所述缺失是指完全缺失或基因序列的部分缺失或单个核苷酸的突变。
[0009]本专利技术所示的一种基因缺失的减毒的非洲猪瘟病毒，其特征在于：构建的含I73R基因缺失的重组病毒。
[0010]进一步的，本专利技术所示的一种基因缺失的减毒的非洲猪瘟病毒是含有I73R基因缺失，进一步优选的，可以同时联合其他基因的多个基因缺失的非洲猪瘟病毒减毒株。
[0011]本专利技术所示的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒，其特征在于：其涉及的基因组包括所有非洲猪瘟病毒(不同基因型)的毒力分离株。
[0012]本专利技术所述的一种缺失I73R基因的非洲猪瘟病毒减毒株活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)I73R基因缺失病毒的构建
[0014]以pUC
‑
19质粒或类似质粒为载体，以I73R基因为目标，构建含该目的基因左右同源臂以及使用p72病毒蛋白启动子调控的EGFP基因替换I73R基因的重组质粒，通过转染BMDM细胞随后感染ASFV亲本毒株的同源重组方式，筛选并纯化得到目的基因缺失的重组病毒ASFV
△
I73R；
[0015]2)疫苗的制备
[0016]将步骤1)中构建的病毒接种原代肺泡巨噬细胞，扩大培养，收获病毒液并测定滴度；以103TCID
50
以上的病毒液制成疫苗。
[0017]本专利技术所述的一种减毒的基因缺失非洲猪瘟病毒疫苗，可与任何形式的佐剂、免疫调节剂同时使用；也可与其他猪用疫苗联合制备使用。
[0018]本专利技术所述的上述非洲猪瘟基因缺失病毒制备的疫苗免疫试验猪后，未出现发热、厌食、精神沉郁等任何异常临床症状；并在攻毒后28天100％健活，且无病毒血症、发热、厌食等症状。证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减毒活疫苗。
[0019]本专利技术的积极效果在于：
[0020]本专利技术公开了一类新的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒；通过对I73R全部基因功能进行缺失，所得的重组毒株与亲本毒株相比，在感染猪后未引起发热、厌食和精神沉郁等症状，试验猪均健活；该类基因缺失活病毒制备的疫苗可保护易感猪免受ASFV强毒的自然感
染或人为攻击，可用于非洲猪瘟的预防。且通过对免疫后28天的安全性评价发现，接种I73R缺失重组病毒的实验猪在接种后21天左右，病毒能够被完全清除，证明该类基因缺失疫苗是一种安全有效的减本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗，其特征在于，所述减毒非洲猪瘟病毒疫苗是含有I73R基因缺失或联合其他基因的多个基因缺失的非洲猪瘟病毒减毒株。2.如权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗，其中所述缺失是指完全缺失或基因序列的部分缺失或单个核苷酸的突变。3.如权利要求1所述的一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)I73R基因缺失病毒的构建以pUC
‑
19质粒或类似质粒为载体，以I73R基因为目标，构建含该目的基因左右同源臂以及使用p72病毒蛋白启动子调控的EGFP基因替换I73R基因的重组质粒，通过转染BMDM细胞随后感染ASFV亲本毒株...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈鸿军，刘英楠，谢振华，宋庆庆，狄栋栋，龚浪，王衡，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司华南农业大学，
类型：发明
国别省市：