IL-17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原制造技术

本发明专利技术涉及选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL

【技术实现步骤摘要】
IL
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17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原
[0001]相关申请
[0002]本申请是2015年12月21日提交的申请号为201580066406.2、专利技术名称为“IL
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17抗体中半胱氨酸残基的选择性还原”的中国专利技术专利申请的分案申请。
[0003]本申请要求2014年12月22日提交的美国临时专利申请第62/095361号的优先权，其通过引用全文纳入。


[0004]本专利技术涉及在通过哺乳动物细胞以重组体方式生产的IL
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17抗体及其抗原结合片段的制品(例如苏金单抗制品)中选择性还原CysL97的方法。
技术背景
[0005]经典抗体由分子量各约为25kD的两个轻链(L)和分子量各约50kD的两个重链(H)组成。轻链和重链通过二硫键(L
‑
S
‑
S
‑
H)连接，两个LH单元还在重链之间通过两个二硫键连接。经典抗体的通式为L
‑
SS
‑
H(
‑
SS
‑
)2H
‑
SS
‑
L或简式H2L2(HHLL)。除了这些保守性链间二硫键以外，还有保守性链内二硫键。这两种二硫键对于抗体的稳定性和行为(例如亲和性)都很重要。一般来说，二硫键通过抗体链中保守性位置处的两个半胱氨酸残基(Cys
‑
SH)产生，它们自发形成二硫键(Cys
‑
S
‑/>S
‑
Cys)。二硫键的形成由环境的氧化还原电势以及由特异于硫醇
‑
二硫化物交换的酶的存在决定。内部二硫键(Cys
‑
S
‑
S
‑
Cys)使得抗体的三维结构稳定化。
[0006]还存在异常抗体，其包含参与抗原识别和结合的额外的游离半胱氨酸(即，不成对的半胱氨酸)。对于这些抗体，游离半胱氨酸的改性会对该分子的活性和稳定性产生负面影响，并会导致提高的免疫原性。结果是难以处理这些抗体，因为最终产物可能包含显著量的惰性、错误折叠且无用的抗体材料。通过引用全文纳入的US20090280131提供了IL
‑
17抗体，例如苏金单抗(即，AIN457)，其在轻链互补决定区(CDR)3环(L
‑
CDR3)中顺
‑
脯氨酸之后存在游离半胱氨酸(即，SEQ ID NO:6所示L
‑
CDR3的氨基酸8，其对应于SEQ ID NO:10所示轻链可变区的氨基酸97，后文称为“CysL97”)。为了保持完全活性，苏金单抗的不成对的半胱氨酸残基不能通过与其他半胱氨酸残基的氧化性二硫配对或通过与外源化合物的氧化(例如，与其他蛋白质形成混合的二硫键，与细胞代谢产物[例如半胱氨酸或谷胱甘肽]发生衍生作用，以及通过氧气形成亚砜)而被掩蔽。不幸的是，由于苏金单抗是使用哺乳动物细胞制造的，的确会发生不利的基于细胞的CysL97改性。
[0007]该文献描述了在细菌细胞中表达的哺乳动物蛋白质的再折叠，其产生作为具有混合二硫键的未折叠不溶性聚集体(包含体)的哺乳动物蛋白质。为了从细菌获得哺乳动物蛋白质，要用强离液剂和还原剂对包含体蛋白质进行分离、溶解和变性。使用变性剂、还原剂、二硫加合物形成剂和温和的氧化/还原环境(pH 7
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9)的完全变性与还原二硫键也已用来正确地再折叠得自商业来源或在酵母中重组产生的植物蛋白质(US 4766205)。这些采用蛋白质的完全变性和再折叠的工艺昂贵、苛性、耗时，且对于在哺乳动物细胞中产生的蛋白质是
不必要的。
[0008]已知使用还原/氧化偶联剂来纠正非自然产生的Fc融合蛋白的错误折叠(WO02/68455)。据推测WO02/68455的Fc融合蛋白在Fc区域中包含链间二硫键，其通过所揭示的工艺被还原并被再氧化，但其中没有指出如何生产具有被选择性还原的半胱氨酸残基的分子。而且，Fc融合蛋白显然并非抗体，抗体是高度复杂的免疫球蛋白，其结构和活性依赖于无数正确连接的链间和链内二硫键。
[0009]US20050123532提供了通过用还原剂活化抗体、或通过在补充有L
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半胱氨酸的无血清培养基中培育抗体产生细胞来生产具有游离半胱氨酸的抗体的方法。使用这种细胞培育方法时，之后的处理步骤例如过滤、病毒灭活和色谱法会导致通过细胞培育方法生产的游离半胱氨酸发生氧化。在这种情况中，通过用氧化剂改性游离的硫醇基团使之后步骤过程中游离半胱氨酸理想地得到保护，之后采用各种技术例如过滤除去该氧化剂(US20060257393)。对于商业生产，这种方法在原始培育培养基中需要大量还原剂，在之后处理过程中需要大量氧化剂，并且需要额外的过滤方法来除去氧化剂，增加了生产消耗的时间以及费用。
[0010]美国专利第7928205号提出了优先使用氧化还原对来再折叠得自哺乳动物细胞培育的IgG2抗体，以及使146B7(IgG1)抗体的可变区中的游离半胱氨酸脱半胱氨酰基化(decysteinylation)的方法。相应的研究出版物：Banks等的《药物科学杂志》(J.Pharmaceutical Sci.)97:764
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779(2008)指出了对重组单克隆IgG1抗体(MAB007)的可变区中的不成对巯基的脱半胱氨酰基化。Banks等研究了MAB007的脱半胱氨酰基化是否需要使用强变性剂(GdnHCL)和还原剂(半胱氨酸)，或是否能在仅存在半胱氨酸时发生选择性还原。这些作者确定，在存在和不存在变性剂的情况下有效地从MAB007中除去了半胱氨酰基。
[0011]以上参考文献都没有指出是否能在苏金单抗中选择性还原CysL97。以上参考文献也没有指出在苏金单抗中选择性还原CysL97所需的试剂和条件，其取决于苏金单抗的一级、二级和三级结构；苏金单抗中被氧化的CysL97的位置和场所(例如溶剂可接近的或不可接近的)；以及抗体中保守性二硫键的相对强度(例如CysL97是否首先与给定的还原剂反应，或只有在保守性半胱氨酸被还原之后再反应)等等。而且，这些参考文献都未描述苏金单抗中被氧化的CysL97的选择性还原是否会导致改变抗体结构(例如折叠)、化学组成(例如脱酰氨基化)、或性质(结合活性、聚集或降解倾向)，所有这些都使得商业规模地选择性还原苏金单抗在技术上是不可行/不现实的。
[0012]专利技术概述
[0013]为了保持最大的苏金单抗抗原结合活性，专利技术人确定需要在处理苏金单抗过程中将CysL97从被掩蔽的式(1)转化成游离的式(2)形式(见以下I)而不明显还原保守性二硫键；否则就会因链脱连接而形成较低活性和非活性的较低分子量变体(H2L2→
H2L，HL2，HL，H和L)。
[0014](I)H2L2‑
Cys
‑
SX+试剂
→
H2L2‑
Cys
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种选择性还原由哺乳动物细胞重组产生的IL
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17抗体制品中的CysL97的方法，其包括:a)使该制品与还原剂接触以形成还原混合物，所述还原剂通过硫醇
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二硫化物交换测得的在pH 7.0时的标准氧化还原电势E0为约
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0.20V至约
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0.23V；和b)将该还原混合物在i.约37℃的温度下在厌氧条件下孵育至少约4小时，或ii.约18
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24℃的温度下孵育约16
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24小时；其中该IL
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17抗体各自包含免疫球蛋白重链可变区(V
H
)和免疫球蛋白轻链可变区(V
L
)，该V
H
包含如SEQ ID NO:8所示V
H
的三个互补决定区(CDR)，该V
L
包含如SEQ ID NO:10所示V
L
的三个CDR。2.根据权利要求1的方法，其中，所述还原混合物中的还原剂的浓度为约1.0mM to 20mM、约4.0mM至约19mM、约2.0mM至约8.0mM、或约4.0mM至约8.0mM。3.根据权利要求1的方法，其中，所述还原混合物中的还原剂的浓度为约4.8mM至约8.0mM、约5.5mM至约6.7mM、或约6.0mM。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中还原剂:抗体的摩尔比为约11:1至约462:1、约31:1至约545:1、约31:1至约156:1、约21:1至约296:1、或约46:1至约91:1之间。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述选择性还原利用还原剂和氧化剂进...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：