一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用。所述DNA纳米载体复合物包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。最后一个连接。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着社会经济发展和人民生活水平提高，饮食结构的改变等因素使得慢性非传染病已经成为导致死亡的主要原因，其中癌症是目前全世界的主要死亡原因之一。针对癌症治疗，目前常用的方法是化学药物治疗。但由于化疗药物在静脉给药后，会表现出非特异性分布和血液半衰期较短的现象，使其容易暴露在正常器官并由肾脏排出，使得化疗效果具有一定局限性。
[0003]所以开发有效的治疗方法是人类在生物医疗面临的重大挑战。具有位点特异性的传递系统逐渐成为诊疗癌症的研究热点，采用基因治疗的方法，构建纳米载体并在体内阻止蛋白表达的RNAi技术成为一种新思路。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近年来发展起来的一种基因治疗技术，即将目的基因所对应的小分子双链RNA(dsRNA)导入生物体，使相应的mRNA降解，从而阻断细胞中特定基因的表达。用RNAi能够特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而治疗各种癌症。小干扰RNA(siRNA)是19～21个碱基对的双链核糖核酸，通过RISC复合物导致目标基因的酶降解，是沉默特定蛋白质编码基因的有效RNAi工具。但在应用上却也面临着很多挑战，以癌症为例：静脉注射到体内的裸siRNA体内半衰期短(<15min)，且易被核酸酶降解；由于其本身是负电性的生物大分子(分子量约为13000)，难以渗透到整个实体瘤组织，即使有少量siRNA进入癌细胞，也很难从内涵体中逃逸出来发挥作用。
[0004]为克服这些局限性，需要寻求合适的递送载体。利用DNA碱基互补配对的原则，基于滚环扩增技术制备DNA纳米结构开始出现。滚环扩增技术是一种等温酶DNA聚合反应，环状模板在聚合酶和dNTPs的作用下，扩增出很多串联重复序列的长链。利用RCA产物的周期性、大分子量性，将此作为脚手架链，再利用几条订书钉链构建出预设形状，能够在极大程度上简化组装设计和实验过程。
[0005]DNA纳米结构虽然具有强大的载药能力，但缺乏选择性，不能实现对癌细胞的主动靶向。而适配体概念的提出为特异性识别癌细胞提供了可能。适配体由指数富集配体系统进化技术(SELEX)发展而来，本质是由单链寡核苷酸折叠而形成的三维结构。由于适配体所具有的高特异性、高灵敏度、易于体外合成和修饰、稳定性好等优点，它被广泛用于生物标记物检测、靶标癌细胞等，也已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。但单价适配体存在定向性差、细胞内化效率低等缺点。于是在此基础上借鉴多价协同相互作用又构建了多价适配体，多个适配体同时与靶标癌细胞上的受体结合以实现高结合亲和力和选择性，细胞膜上的多价配体受体又可以促进细胞内吞。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种以滚环扩增产物为支架链的周期性循环的DNA靶向载体，引入多价适配体，采用RNAi技术实现负载药物和靶向基因的递送。既采用多价分子载药体系，又结合可以靶向抑制癌细胞增殖的siRNA双链，从而实现siRNA和Dox的共递送，达到对癌细胞的抑制及杀灭双重效果，为高效精准的癌症治疗提供新方案。
[0007]为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
[0008]第一方面，本公开提供了一种DNA纳米载体复合物，包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，
[0009]其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，优选地，a为50～100的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。
[0010]本专利技术的DNA纳米载体复合物中，优选地，具有a个串联的重复单元的长单链DNA可以是基于滚环扩增的长单链DNA分子。滚环扩增产物具有周期性、大分子量性，将此作为脚手架链，再利用几条订书钉链构建出DNA纳米靶向载体，可以极大简化组装设计和实验过程，在此基础上构建多价适配体DNA纳米靶向载体。本专利技术中，长单链DNA具有周期性、大分子量性的优势，其长度主要受到滚环扩增(RCA)反应时间和dNTPs浓度影响，长度可以选择约4000bp
‑
19000bp范围之间，更优选长度为约8000bp。在一个实施方式中，长链DNA分子链有约127个串联的63碱基重复序列；长链DNA分子链A分子量约19708g/mol。
[0011]本专利技术的DNA纳米载体复合物中，所述互补DNA单链可以是任意可与长单链DNA互补配对的DNA短链分子，其与所述重复单元形成双螺旋结构，但其序列设计要尽量避免形成发卡结构、G
‑
四联体等特殊的DNA二级结构。
[0012]本专利技术的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述适配体链包括能够特异性识别癌细胞的适配体，并通过在适配体末端延长的未配对碱基与DNA长单链上碱基互补配对连接。适配体的实例包括但不限于AS1411适配体、HA09适配体、Sgc8适配体。其中优选AS1411适配体。在一些实施方式中，所述适配体链包括癌细胞适配体，所述癌细胞适配体优选为选自以下各项中的一种或多种：AS1411(核仁蛋白特异核酸适配体)、人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8等，其中优选AS1411。更优选地，所述适配体5
’
端标记荧光基团。
[0013]本专利技术的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述锚定链用于连接治疗基因(如siRNA)，其是一段单链寡核苷酸(指60个以下碱基的短链核苷酸的总称)序列(即RNA锚定链)，通过自身的粘性末端与所述治疗基因延伸出的多个特定碱基杂交，从而负载所述治疗基因。所述锚定链可以分为两段杂交区域，一段杂交区域的序列必须与长单链DNA分子互补，另一段杂交区域的序列与治疗基因如siRNA正义链延伸出的碱基互补，前者形成杂交区域的序列可选择任意互补碱基，但后者短单链DNA分子的序列设计要尽量避免形成发卡结构、G
‑
四联体等特殊的DNA二级结构。在一个具体实施方式中，所述锚定链的长度为25
‑
70bp。
[0014]本专利技术的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述治疗基因是指包含粘性末端以与锚定链连接的治疗基因，其在进入肿瘤细胞后因其具有针对性使得治疗癌症效率更高。其实例例如抑制致病性RNA活性的小干扰RNA(siRNA)、编码治疗性蛋白的基因或编码疫苗抗原(mRNA)的基因等。在一些实施方式中，所述治疗基因可为抑制癌细胞转移、增殖的基因，优选为选自以下各本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA纳米载体复合物，包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，优选地，a为50～100的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。2.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA是基于滚环扩增的长单链DNA分子，优选地，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA的长度为4000bp
‑
19000bp，更优选约8000bp，还更优选地，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA具有约127个串联的63碱基重复序列。3.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述适配体链包括能够特异性识别癌细胞的适配体，并通过在适配体末端延长的未配对碱基与DNA长单链上碱基互补配对连接，优选地，所述适配体为选自以下各项中的一种或多种：AS1411(核仁蛋白特异核酸适配体)、人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8，更优选地，所述适配体5
’
端标记荧光基团。4.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述治疗基因包括抑制致病性RNA活性的小干扰RNA(siRNA)、编码治疗性蛋白的基因或编码疫苗抗原的基因，优选地，所述治疗基因为选自以下各项中的一种或多种：信号转导子和转录激活子3小干扰RNA(STAT3 siRNA)、再生肝磷酸酶
‑
3小干扰RNA(PRL
‑
3 siRNA)、结肠癌转移相关基因1小干扰RNA(MACC1 siRNA)，其中优选STAT3 siRNA。5.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述长单链DNA的重复单元具有如SEQ ID NO:3所示的序列；所述锚...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志庆，徐东彦，王芳，杨春天，姜贤红，
申请(专利权)人：安丘市增塑剂厂，
类型：发明
国别省市：