用于高水平表达外源基因的表达载体制造技术

本公开涉及一种用于高水平表达外源基因的表达载体，该表达载体包含一种增强基因表达的调控核酸分子，所述调控核酸分子按5'到3'顺序包含腺病毒的三联前导序列(TPL)和腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)。该表达载体可以显著提高外源基因的表达水平，可以将胞内的外源基因编码的蛋白表达水平提高数十倍以上，将分泌型的外源基因编码的蛋白水平提高数倍。数倍。

【技术实现步骤摘要】
用于高水平表达外源基因的表达载体


[0001]本公开涉及一种基因表达载体，特别是一种介导外源基因在细胞中高效表达的载体及其应用。

技术介绍

[0002]利用载体将外源基因递送至特定的组织或者细胞，通过表达的外源蛋白或者非编码的RNA分子治疗或者预防遗传疾病、肿瘤、退行性病变等疾病，是一种前景广阔的治疗方式。
[0003]病毒载体是近年发展迅猛的一种基因递送载体，其中腺相关病毒(AAV)的载体由于低免疫原性、非整合性和介导外源基因长期表达的特性逐渐成为最佳的基因治疗载体选择。
[0004]研究者已经开发出了CMV和CAG等转录活性较高的启动子，已提高外源基因表达效率。但是哺乳动物细胞中的基因表达水平受到转录水平、转录后mRNA稳定性、翻译水平和翻译后蛋白稳定性等多个水平的调控。因此，在需要递送外源基因至哺乳动物细胞中时，例如在基因治疗，可以从上述的多个角度进行优化，比如基因转录和翻译调控元件、外源基因的拷贝数、外源基因在宿主细胞基因组中的整合位点、RNA的加工和mRNA的稳定性、宿主细胞本身对蛋白的翻译修饰等。
[0005]因此，需要用于在细胞中，特别是在哺乳动物细胞中表达基因的经过改进的方法和经过优化的表达载体，以保障外源基因的长期高水平表达。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术中存在的问题，本公开提供了一种本专利技术提出了包含多种促进和维持外源基因表达的序列元件，以保障外源基因的长期高水平表达。
[0007]因此，在一方面，本公开提供了一种增强基因表达的调控核酸分子，所述调控核酸分子按5'到3'顺序包含腺病毒的三联前导序列(TPL)和腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)，其中：
[0008]所述腺病毒的三联前导序列(TPL)具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的TPL序列或与其具有至少85％同一性的序列；
[0009]所述腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的eMLP序列或与其具有至少85％同一性的序列。
[0010]在一方面，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体按5'到3'顺序包含：
[0011](a)启动子区；
[0012](b)5'UTR区；
[0013](c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；
[0014](d)多腺苷酸化区(polyA)；
[0015]其中，所述5'UTR区包含前述的调控核酸分子；
[0016]所述编码序列可操作地连接到所述启动子区。
[0017]在一方面，本公开提供了一种重组病毒，其包含：
[0018]a)衣壳蛋白；以及
[0019]b)前述的表达载体。
[0020]在一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含前述的表达载体和/或重组病毒和药学上可接受的赋形剂。
[0021]在一方面，本公开提供了一种用前述的表达载体转染或转导的分离的宿主细胞。
[0022]在一方面，本公开提供了一种用前述的重组病毒感染的分离的宿主细胞。
[0023]在一方面，本公开提供了一种用于在哺乳动物细胞中表达转基因的方法，所述方法包含使一个或多个哺乳动物细胞与一定量的前述的表达载体和/或重组病毒接触，其中以一定水平在所述一个或多个哺乳动物细胞中表达所述分泌多肽。
[0024]在一方面，本公开提供了一种用于治疗或预防有疾病治疗或预防需要的哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的前述的表达载体、重组病毒、药物组合物和/或宿主细胞。
[0025]本专利技术可以显著提高aflibercept的表达水平，相对于单纯的CMV启动子/增强子启动aflibercept表达框的载体，可以将胞内的aflibercept蛋白表达水平提高数十倍以上，将分泌型的aflibercept蛋白水平提高数倍。
附图说明
[0026]图1示出了本公开的AO表达载体的结构。
[0027]图2示出了Aflibercept表达载体转染293T细胞(图2A)和ARPE-19细胞(图2B)后细胞内的Aflibercept蛋白水平。
[0028]图3示出了Aflibercept表达载体转染293T细胞(图2A)和ARPE-19细胞(图2B)后上清中的Aflibercept蛋白水平。
[0029]图4示出了AAV病毒感染ARPE-19细胞后细胞内的aflibercept蛋白水平。
[0030]图5A示出了AAV病毒感染ARPE-19细胞后细胞内的平均AAV基因组拷贝数；图5B示出了AAV病毒感染ARPE-19细胞后，细胞内每个AAV病毒基因组拷贝对应的上清中分泌性Aflibercept蛋白水平。
[0031]图6示出了Aflibercept表达载体转染或AAV病毒感染293T细胞和ARPE-19细胞后细胞内及分泌性Aflibercept的相关性分析。
[0032]图7示出了BN大鼠视网膜注射AO病毒后细胞内及分泌性Aflibercept蛋白水平，其中，BLK为未注射AO病毒的对照大鼠眼球取材样品；B2_20R、B2_21R和B2_22R为注射了AO-1病毒的大鼠眼球取材；B2_26R、B2_26L和B2_29L为注射了AO-2病毒的大鼠眼球取材；B2_30L、B2_31L和B2_32R为注射了AO-3病毒的大鼠眼球取材；B2_37R、B2_36L、B2_38R和B2_39L为注射了AO-4病毒的大鼠眼球取材。
具体实施方式
[0033]定义
[0034]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术
人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0035]如本文所使用的，“载体”是指高分子或高分子的缔合，所述高分子或高分子的缔合包括多核苷酸或与所述多核苷酸相关并且可以用于介导向细胞递送所述多核苷酸。说明性载体包含例如质粒、病毒载体(即病毒，如腺相关病毒)、脂质体和其它基因递送媒剂。
[0036]术语“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的和重组的形式，除非另有要求。术语“AAV”包含AAV 1型(AAV-1)、AAV 2型(AAV-2)、AAV 3型(AAV-3)、AAV 4型(AAV-4)、AAV 5型(AAV-5)、AAV 6型(AAV-6)、AAV 7型(AAV-7)、AAV 8型(AAV-8)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV以及绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强基因表达的调控核酸分子，所述调控核酸分子按5'到3'顺序包含腺病毒的三联前导序列(TPL)和腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)，其中：所述腺病毒的三联前导序列(TPL)具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的TPL序列或与其具有至少85％同一性的序列；所述腺病毒的主要晚期启动子的增强子元件(eMLP)具有选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的eMLP序列或与其具有至少85％同一性的序列。2.根据权利要求1所述的调控核酸分子，其中，所述调控核酸分子具有选自SEQ ID NO:19-34所示序列或与其具有至少85％同一性的序列；优选地，所述调控核酸分子具有SEQ ID NO:22、25、26或33所示序列或与其具有至少85％同一性的序列。3.根据权利要求1或2所述的调控核酸分子，其中，所述调控核酸分子具有SEQ ID NO:26所示序列或与其具有至少85％同一性的序列。4.一种表达载体，所述表达载体按5'到3'顺序包含：(a)启动子区；(b)5'UTR区；(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；(d)多腺苷酸化区(polyA)；其中，所述5'UTR区包含权利要求1-3任一项所述的调控核酸分子；所述编码序列可操作地连接到所述启动子区。5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述(a)启动子区选自巨细胞病毒(CMV)启动子、肌动蛋白启动子、延伸因子1α(EF1α)启动子和甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子；所述(a)启动子区包含SEQ ID NO:9所示的巨细胞病毒(CMV)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列。6.根据权利要求4或5所述的表达载体，其中，所述多肽基因产物为治疗性蛋白质；优选地，所述治疗性蛋白选自抗血管生成多肽或α-1抗胰蛋白酶；优选地，所述抗血管生成多肽包含可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFLT-1)或sFLT-1的VEGF结合片段；更优选地，所述抗血管生成多肽为阿柏西普(aflibercept)；优选地，阿柏西普(aflibercept)的氨基酸如SEQ ID NO:10所示；更优选地，阿柏西普(aflibercept)的编码核酸如SEQ ID NO:11所示。7.根据权利要求4-6任一项所述的表达载体，其中，所述多腺苷酸化区选自人生长激素(HGH或hGH)、牛生长激素(BGH或bGH)或β-珠蛋白(β珠蛋白)polyA序列；更优选地，所述多腺苷酸化区包含SEQ ID NO:12所示的牛生长激素(BGH或bGH)polyA序列或与其具有至少85％同一性的序列；优选地，所述表达载体包含SEQ ID NO:35、36、37或38所示的序列或与其具有至少85％同一性的序列。8.根据权利要求4-7任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体还包含(i)第一增强子区，所述(i)第一增强子区位于所述(a)启动子区上游；优选地，所述(i)第一增强子区包含选自CMV增强子或EF1α增强子的序列；
更优选地，所述(i)第一增强子区包含SEQ ID NO:13所示的CMV增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列。9.根据权利要求4-8任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体还包含(ii)内含子区，所述(ii)内含子区位于所述(b)5'UTR区的下游且位于所述(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列的上游；优选地，所述(ii)内含子区包含选自SV40内含子、延伸因子1α(EF1α)内含子、肌动蛋白内含子或CMVc内含子的序列；更优选地，所述(ii)内含子区包含SEQ ID NO:14所示的SV40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列。10.根据权利要求4-任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体还包含(iii)第二增强子区，所述(iii)第二增强子区位于所述(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列的下游且位于所述(d)多腺苷酸化区的上游；优选地，所述(iii)第二增强子区包含表达增强子序列(EES)；优选地，所述(iii)第二增强子区包含干扰素的支架附着区(SAR)；优选地，所述支架附着区序列(SAR)为人β-干扰素的人支架附着区(IFNB SAR)；更优选地，所述人β-干扰素人支架附着区(IFNB SAR)包含SEQ ID NO:15所示的SAR序列或与其具有至少85％同一性的序列。11.根据权利要求4-10任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体还包含位于所述(i)第一增强子上游的(iv)5'末端的反向末端重复序列(ITR)和位于所述(d)多腺苷酸化区下游的(v)3'末端的反向末端重复序列(ITR)；优选地，所述(iv)5'末端的反向末端重复序列(ITR)或所述(v)3'末端的反向末端重复序列(ITR)包含选自腺病毒(AV)或腺相关病毒(AAV)的反向末端重复序列(ITR)；更优选地，所述(iv)5'末端的反向末端重复序列(ITR)包含SEQ ID NO:16所示的AAV ITR或与其具有至少85％同一性的序列；更优选地，所述(v)3'末端的反向末端重复序列(ITR)包含SEQ ID NO:17所示的AAV ITR或与其具有至少85％同一性的序列。12.根据权利要求4-11任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体还包含(vi)选择标记基因；优选地，所述(vi)选择标记基因位于所述(v)3'末端的反向末端重复序列(ITR)的下游；优选地，所述(vi)选择标记基因选自氨苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、双丙氨磷抗性基因和二氢叶酸还原酶基因；优选地，所述氨苄青霉素抗性基因包含SEQ ID NO:18所示的序列或与其具有至少85％同一性的序列。13.根据权利要求4-12任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体按5'到3'包含：(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含SEQ ID NO:13所示的CMV增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；(a)启动子区，所述启动子区包含SEQ ID NO:9所示的巨细胞病毒(CMV)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；
(b)5'UTR区，所述5'UTR区包含由SEQ ID NO:2所示的TPL序列和SEQ ID NO:8所示的eMLP序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列；(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含SEQ ID NO:15所示的SAR序列或与其具有至少85％同一性的序列；以及(d)多腺苷酸化区，所述多腺苷酸化区包含SEQ ID NO:12所示的牛生长激素(BGH或bGH)polyA序列或与其具有至少85％同一性的序列，并且任选地其中所述表达载体不包含RNA输出信号。14.根据权利要求4-13任一项所述的表达载体，其中，所述表达载体按5'到3'包含：(i)第一增强子区，所述第一增强子区包含SEQ ID NO:13所示的CMV增强子序列或与其具有至少85％同一性的序列；(a)启动子区，所述启动子区包含SEQ ID NO:9所示的巨细胞病毒(CMV)启动子序列或与其具有至少85％同一性的序列；(ii)内含子区，所述内含子区包含SEQ ID NO:14所示的SV40内含子序列或与其具有至少85％同一性的序列；(b)5'UTR区，所述5'UTR区包含由SEQ ID NO:2所示的TPL序列和SEQ ID NO:8所示的eMLP序列组成的调控核酸分子或与其具有至少85％同一性的序列；(c)对多肽基因产物进行编码的编码序列，其中，所述编码序列可操作地连接到所述启动子区；(iii)第二增强子区，所述第二增强子区包含SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢兴旺，刘海燕，
申请(专利权)人：北京安龙基因医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：