用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.4启动子片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测细胞缺氧状态和HIF1α蛋白活性的RCAN1.4启动子片段及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术采用双荧光素酶报告基因检测系统，将RCAN1.4

【技术实现步骤摘要】
用于细胞缺氧和HIF1
α
蛋白活性指示剂的RCAN1.4启动子片段及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种用于细胞缺氧和HIF1α蛋白活性指示剂的RCAN1.4
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15启动子片段及其应用。

技术介绍

[0002]RCAN1基因位于位于唐氏综合症关键区域(Down Syndrome Critical Region，DSCR)，包括7个外显子和6个内含子，其中前4个外显子为选择性外显子，不同的表达可以产生4种不同的蛋白亚型，其中最主要的是外显子1编码的RCANl.1和外显子4编码的RCANl.4。RCAN1基因有两个转录起始位点，分别位于外显子1和外显子4前面，外显子5，6，7编码的168个氨基酸为高度保守区域，在所有RCAN1亚型中均表达，并包含有钙调磷酸酶结合域。研究表明，RCAN1对钙调磷酸酶的信号转导通路具有双重调控作用，并参与了核转录因子NF
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kB信号通路的调控，在细胞凋亡、细胞分化和记忆等生理过程中都有非常重要的调节作用，被认为与多种疾病相关。研究发现在阿尔茨海默病(Alzheimer
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s disease，AD)患者中，RCAN1高度过量表达且AD患者大脑中Aβ的大量沉积直接引起RCAN1的表达增加，上调的RCAN1抑制了钙调磷酸酶的活性，使得去磷酸化作用减弱，高度磷酸化的tau蛋白累积，导致螺旋状的神经原纤维缠结，进一步导致神经元死亡，加重了AD的症状。另有研究发现在脑受缺血/再灌注损伤的早期，星形胶质细胞中，RCAN1.4蛋白表达水平明显升高，在大脑缺血性损伤和神经炎性病变中起到一定的保护作用。众多的研究结果提示，RCAN1对多种疾病的发生发展都具有重要作用。
[0003]哺乳动物和人体内细胞存在着一类介导低氧适应性反应的转录因子，能激活许多低氧反应性基因(hypoxia responsive genes，HRG)的表达，是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质，称低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor，HIF1)。HIF1转录因子包括两个亚单位，即低氧调控的α亚单位(HIF1α)和对氧不敏感的β亚基HIF1β，其中HIF1α是决定HIF1功能的关键亚基。人HIF1α的基因位于第14号染色体(14q21
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4)上，属于HIFs(hypoxia inducible factors,HIFs)家族。研究表明，细胞低氧状态可诱导HIF1α的表达，其在体内介导的生理或病理作用主要通过与目的基因的低氧反应元件(Hypoxia response element,HRE)结合而调节目的基因的表达来实现。现已发现受HIF1α调控的下游目的基因包括促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric
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oxide synthase,iNOS)、血红素氧合酶
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1(heme oxygenase
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1,HO
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1)等五十多种基因的表达，进而来介导机体的一系列低氧适应性反应如红细胞生成，血管舒张，血管生成和糖酵解等等。因此，HIF1α参与多种生理过程，对多种疾病均有调控作用，HIF1α蛋白活性的检测意义重大。
[0004]目前的研究多是通过WB法检测HIF1α蛋白表达水平进而指示细胞缺氧程度，通过与正常条件下的对照相比HIF1α蛋白的表达量，确定细胞的缺氧状态。该方法的弊端在于，WB操作步骤较为繁琐复杂，细胞裂解时要在裂解液中及时添加足量的仍处于有效期内的蛋
白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以减缓蛋白的降解，从收集细胞、细胞裂解、离心至免疫沉淀反应等需要全程保持在0
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4℃条件下操作，且反应用时长，通常需要四小时至过夜孵育，长时间暴露于4℃环境即使在有蛋白酶抑制剂的条件下仍易导致蛋白降解。另外，HIF1α蛋白在常氧条件下极易迅速降解，要求操作过程必须熟练且快速，否则结果将会受到影响。再者，目前市面上HIF1α的抗体与同规格其他普通蛋白抗体相比，价格高昂，活性不够稳定、存放时间短等缺点，对结果的准确性有一定的影响。
[0005]总体来说，这类方法检测起来费时费力，结果不稳定且检测成本较高。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在提供一种能够被HIF1α蛋白激活的RCAN1.4启动子片段及其应用，本专利技术还提供了一种能够利用双荧光素酶报告基因指示细胞缺氧程度和HIF1α蛋白活性的方法及其应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术的第一目的是提供一种RCAN1.4启动子片段，所述RCAN1.4启动子片段为RCAN1.4
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15启动子片段，该启动子片段为下列序列之一：
[0009]1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
[0010]5’‑
CTGTTTTTTCCATTCTCCCCAAGCAAAGTTAATTAGCATAGGGAAAA TGACTAAGGTGTTGACGTCACCTCTTTCCAGTAGAAACTTACACTTTGTCCCTGTCTGCCTGCAAGCATGCAGGACTTGACTCAGGAATTTGCTGTCCAAACAGGATGCTGTGGAAGCTGCACTTTTTTTTTCCCCAGGGAGTGGGGGCTGGCCCTTACTGCTTTATAAGCACCAGCTCAAGAAGGAACCTACAGCCTCTTGGAAAGGAATCTCACTAGGGGCTTGACTGCGTGGGTCTGTAGCGCTTTCAC
‑3’
(SEQ ID NO.1)
[0011]2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供一种指示载体，该指示载体含有根据上述所述的RCAN1.4
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15启动子片段和含有报告基因的空白载体pGL3
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basic。
[0013]本专利技术的第三个目的是提供一种细胞，该细胞系含有上述所述的指示载体。
[0014]本专利技术的又一个目的是提供一种工程菌，该工程菌含有上述所述的指示载体。
[0015]本专利技术的又一个目的是提供一种利用双荧光素酶报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的方法，包括如下步骤：
[0016]S1、将生长状态良好、处于对数生长期的HEK293细胞接种到48孔培养板中，37℃、5％C02饱和湿度培养箱中贴壁培养；
[0017]S2、构建如上述所述的指示载体；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RCAN1.4启动子片段，其特征在于，所述RCAN1.4启动子片段为RCAN1.4
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15启动子片段，该启动子片段为下列序列之一：1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。2.一种指示载体，其特征在于，该指示载体含有根据权利要求1所述的RCAN1.4
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15启动子片段和含有报告基因的空白载体pGL3
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basic。3.一种细胞，其特征在于，该细胞系含有权利要求2所述的指示载体。4.一种工程菌，其特征在于，该工程菌含有权利要求2所述的指示载体。5.一种利用双荧光素酶报告基因检测HIF1α蛋白表达变化的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将生长状态良好、处于对数生长期的HEK293细胞接种到48孔培养板中，37℃、5％C02饱和湿度培养箱中贴壁培养；S2、构建如权利要求2所述的指示载体；S3、将指示载体转染入48孔培养板的HEK293细胞中，转染时细胞密度约为70
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80％；S4、转染48小时后，将细胞进行或不进行缺氧(1％O2)处理，检测指示载体中报告基因的表达变化，进而判断指示载体中RCAN1.4
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15启动子片段的激活情况，从而判断HIF1α蛋白表达变化。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨夏鑫，孙秀莲，运岩，王频，
申请(专利权)人：山东大学齐鲁医院，
类型：发明
国别省市：