光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种光皮桦的miR156a前体基因在调控植物分枝数量中的应用。本发明专利技术提供的光皮桦miR156a前体基因，该前体基因序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还提供了光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用。通过光皮桦miR156a前体基因的过量表达，有望人为地促进植物分枝的形成，增加侧枝的数量，在调控植物株形及产量等方面有重要的应用前景。物株形及产量等方面有重要的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用


[0001]本专利技术属于植物生物
，涉及一种光皮桦miR156a前体基因及在促进植物分枝形成中的应用。

技术介绍

[0002]microRNA(miRNA)是一类长度约为20
‑
24nt内源非编码单链RNA分子，具有调控基因表达的功能，在植物的生长发育、信号转导和胁迫响应等过程中起着关键作用。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区。在植物中，细胞核内编码miRNA的基因在转录后经过一系列加工成为成熟的双链miRNA分子，该双链miRNA与沉默复合体RISC结合，通过剪切靶mRNA或抑制靶mRNA翻译来负调控基因表达。
[0003]MicroRNA156s(miR156s)是植物microRNAs中最为保守成员之一，在种子萌发、发育阶段转变、分蘖、花青素合成和赤霉素信号转导等方面有重要的调控作用。研究也显示，不同的miR156基因通过靶向不同的基因，在植物中发挥不同的功能。miR156在树木中调控分枝形成的作用尚未见有报道，因此，利用基因工程技术，将从光皮桦中克隆获得miR156a前体基因转入其它植物中，对于研究其功能具有重要意义，同时极具应用前景。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种光皮桦miR156a前体基因及其促进在植物分枝形成中的应用。
[0005]本专利技术提供一种光皮桦miR156a成熟miRNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]本专利技术还提供一种编码所述光皮桦miR156a成熟miRNA的前体基因。
[0007]在一个实施方案中，该光皮桦miR156a前体基因的序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]本专利技术提供了含有上述基因的重组载体、宿主细胞、转基因细胞系或重组菌。
[0009]在一个实施方案中，该重组菌为将上述基因插入表达载体得到的重组菌。
[0010]另一方面，本专利技术提供了一种光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用，该基因的序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0011]在一个实施方案中，该光皮桦miR156a前体基因经剪切后的成熟序列为SEQ ID NO：1。
[0012]在一个实施方案汇总，将所述前体基因转入寄主植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，促进植物分枝形成。
[0013]在一个实施方案中，该植物为烟草或拟南芥。
[0014]在一个实施方案中，该植物为烟草。
[0015]在一个实施方案中，包括：将包含上述光皮桦miR156a前体基因连接到过表达载体上，利用农杆菌介导转化到烟草，通过筛选和培养获得转基因株系。
[0016]本专利技术还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述
前体基因的过表达载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株，所述的转基因植株与野生型相比，转基因植株分化生长出更多的分枝。
[0017]本专利技术提供了光皮桦miR156a前体基因在促进植物分枝形成中的应用。通过光皮桦miR156a前体基因的过量表达，有望人为地促进植物分枝的形成，增加侧枝的数量，在调控植物株形及产量等方面有重要的应用前景。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的光皮桦叶片的基因组DNA。
[0019]图2为光皮桦miR156a前体的表达载体菌液PCR检测。
[0020]图3为光皮桦miR156a前体转基因烟草植株的抗性筛选。
[0021]图4为转基因烟草miR156a前体表达水平检测。
[0022]图5为过量表达miR156a烟草与野生型烟草分枝数量的比较。
具体实施方式
[0023]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0026]实验材料取自浙江农林大学林木遗传育种实验室的组培苗，品种光皮桦优3，叶片样品采下后立即液氮速冻并放置在
‑
80℃冰箱保存待用。烟草野生型采用本生烟(Nicotiana benthamiana)。
[0027]DNA聚合酶、DNA Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、β
‑
疏基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、NaCl、Tris
‑
HCl等DNA提取试剂购自上海生工生物工程股份有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自爱思进生物技术有限公司，无缝克隆试剂盒购置海南你行生物技术有限公司。PCR仪为美国伯乐PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
[0028]引物合成及测序均由北京擎科生物技术有限公司杭州分公司完成。
[0029]实施例1光皮桦miR156a前体基因克隆
[0030]利用改良CTAB法提取光皮桦叶片基因组DNA(图1)，通过Nanodrop分光光度计测定每个DNA样品的OD260、OD280，并以此计算DNA的浓度及纯度，并在1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。所提DNA的OD260/OD280比值均在1.80
‑
1.90之间，浓度均在200ng/μL以上，说明DNA无多糖、酚及蛋白质的污染；琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA样品条带清晰，大小在10kb以上，可推断DNA没有降解，符合后续实验的要求。
[0031]将光皮桦的基因组DNA用适量ddH2O稀释至50ng/μL后，进行PCR扩增。基因克隆PCR体系如下(25μL)：
[0032][0033]反应程序为：94℃，3min；94℃，30sec，60℃，20sec，72℃，20sec，循环35次；72℃，5min。
[0034]基因克隆所用引物为Primer1:5
’‑
AGGCATCATGTTGACAGAAGAG
‑3’
，Primer2:5
’‑
ATGGAAGTGATGGTGACAGAAG
‑3’
。
[0035]通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测(图2)，然后利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(爱思进)进行目的片段回收。将目的片段连接到pEASY
‑
T1 Cloning Vector后，转化Trans
‑
T1感受态细胞，挑取阳性克隆鉴定和测序，序列如SEQ ID NO：2所示，该光皮桦miR156a前体基因经剪切后的成熟序列如SEQ ID NO：1所示。
[0036]实施例2表达载体构建
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.光皮桦miR156a成熟miRNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。2.编码权利要求1所述光皮桦miR156a成熟miRNA的前体基因。3.如权利要求2所述的前体基因，其特征在于，序列如SEQ ID NO：2所示。4.含有权利要求2或3所述前体基因的载体。5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6.含有权利要求2或3所述前体基因的工程菌。7.权利要求2或3所述前体基因在促进植物分枝形成中的应用。8.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：林二培，黄奕孜，黄华宏，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：