一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a-制造技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a
‑
C
crRNA系统及其应用


[0001]本专利技术属于分析检测
，具体涉及一种基于核酸核酶与环状向导RNA调控的Cas12a
‑
C
crRNA系统及其在生物传感方面的应用。

技术介绍

[0002]分子生物传感对于临床诊断、生物安全、食品安全和环境监测至关重要。目前，CRISPR
‑
Cas系统作为信号放大工具已被广泛用于生物传感领域。研究人员基于CRISPR
‑
Cas体系已建立了许多核酸检测方法，广泛用于传染性或非传染性疾病的诊断。然而，对于非核酸类生物标志物(例如小分子、蛋白质和金属离子)的传感方法数量非常有限，急需拓展。
[0003]在自然界中，共价闭合环状RNA(circRNAs)广泛存在于类病毒、拟病毒中以及真核生物、细菌和古细菌拼接的内含子或外显子中。circRNAs可以通过化学或酶促连接反应制备，是可用于各种功能设备的一类独特的核酸纳米结构。目前，已建立的基于CRISPR
‑
Cas的生物传感系统均利用线状向导RNA(
L
crRNA)引导Cas蛋白识别特定核酸序列，从而激活Cas蛋白对单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)信号报告分子进行切割。由于circRNAs与线状RNA(
L
RNA)相比表现出不同的结构和功能，导致其很少用于CRISPR生物传感系统的开发。
[0004]迄今为止，研究人员设计了多种可以切割RNA的核酸核酶(NAzymes)，例如核糖核酶(Ribozyme)、脱氧核酶(DNAzymes)和适体核酶(Aptazymes)。这些核酸核酶能够识别各种非核酸类的生物标志物，例如金属离子、小分子、寡核苷酸、蛋白质和致病细菌等。然而，利用核酸核酶对环状向导RNA(
C
crRNA)切割来释放
L
crRNA激活Cas12a体系的相关研究还未见报道，这对拓展基于CRISPR
‑
Cas的非核酸类靶标检测具有重要意义。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术首次将
C
crRNA用于CRISPR
‑
Cas12a体系，证明
C
crRNA可以降低Cas12a的切割活性，当NAzyme对
C
crRNA进行切割时，释放出的
L
crRNA可恢复Cas12a的活性；此外，本专利技术构建了核酸核酶激活的Cas12
‑
C
crRNA系统(NA3C)，实现了对小分子5'
‑
三磷酸腺苷(ATP)和两种致病菌(大肠杆菌和肺炎克雷伯菌)的实时、灵敏检测。从而，证明了本专利技术对非核酸类目标物检测的通用性，拓展了CRISPR
‑
Cas技术在生物传感和临床诊断领域的应用。
[0006]本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种环状
C
crRNA，所述的
C
crRNA通过线性
L
crRNA模板和RNA连接模板连接环化获得。
[0008]进一步地，所述的
L
crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
7所示；所述的RNA连接模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：8
‑
13所示。
[0009]本专利技术提供一种基于核酸核酶与
C
crRNA调控Cas12a的NA3C系统，所述的系统包括Cas12a、上述的
C
crRNA和核酸核酶。
[0010]基于以上技术方案，进一步地，所述的核酸核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO：14
‑
20所示的核酸核酶。
[0011]基于以上技术方案，进一步地，所述的系统包括顺式切割底物dsDNA和反式切割底物ssDNA。
[0012]基于以上技术方案，进一步地，dsDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22连接构成或者由SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24连接构成；ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
[0013]基于以上技术方案，进一步地，所述的ssDNA序列的两端分别修饰FAM荧光基团和Dabcyl猝灭基团，Cas12切割ssDNA后，使得荧光基团与荧光猝灭基团分离，产生荧光信号。
[0014]基于以上技术方案，进一步地，所述的系统包括缓冲溶液、RNase抑制剂、氯化镁溶液。
[0015]基于以上技术方案，进一步地，所述的缓冲溶液包括Tris
‑
HCl和Cas12a切割缓冲液，Cas12a切割缓冲液组成为：20mM Tris盐酸，100mM氯化钾，5mM氯化镁，1mM DTT，5％丙三醇，50μg/mL肝素钠，pH 7.5。
[0016]本专利技术一方面提供上述的NA3C系统在生物传感和临床诊断方面中的应用。
[0017]本专利技术另一方面提供一种基于上述的NA3C系统检测ATP或致病菌的方法，包括以下步骤：
[0018](1)在目标物存在的情况下，ATP或致病菌响应的核酸核酶切割
C
crRNA，释放出
L
crRNA；
[0019](2)将步骤(1)中释放的
L
crRNA与Cas12a、顺式切割底物dsDNA混合后，再加入反式切割底物ssDNA后，检测荧光信号。
[0020]基于以上技术方案，进一步地，检测ATP时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
[0021]基于以上技术方案，进一步地，所述的致病菌包括大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。
[0022]基于以上技术方案，进一步地，检测大肠杆菌时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
[0023]基于以上技术方案，进一步地，检测肺炎克雷伯菌时，所述核酸核酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0024]本专利技术还提供一种应用上述的NA3C系统检测临床尿液样本中大肠杆菌的方法，包括以下步骤：
[0025](1)细胞收集：离心收集待检样品中的细菌细胞；
[0026](2)细胞裂解：使用缓冲液洗涤步骤(1)得到的细菌细胞1次以上，将细胞沉淀悬浮于缓冲液中，超声破碎细胞，然后离心收集大肠杆菌的胞内混合物(CIM)；
[0027](3)NA3C检测：将步骤(2)得到的胞内混合物、
C
crRNA、核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的核酸核酶孵育10～60min，取所得混合液与Cas12a和dsDNA混合20～40min，加入反式切割底物ssDNA后，检测荧光信号。
[0028]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0029]本专利技术首次利用<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环状
C
crRNA，其特征在于，所述的
C
crRNA通过线性
L
crRNA模板和RNA连接模板连接环化获得；所述的
L
crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
‑
7所示；所述的RNA连接模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：8
‑
13所示。2.一种基于核酸核酶与
C
crRNA调控Cas12a的NA3C系统，其特征在于，所述的系统包括Cas12a、权利要求1所述的
C
crRNA和核酸核酶；所述的核酸核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO：14
‑
20所示的核酸核酶。3.根据权利要求2所述的NA3C系统，其特征在于，所述的NA3C系统包括顺式切割底物dsDNA和反式切割底物ssDNA；所述的dsDNA的核苷酸序列由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22连接构成或者由SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24连接构成；所述的ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。4.根据权利要求3所述的NA3C系统，其特征在于，所述的ssDNA序列的两端分别修饰FAM荧光基团和Dabcyl猝灭基团，Cas12切割ssDNA后，使得荧光基团与猝灭基团分离，产生荧光信号。5.根据权利要求2所述的NA3C系统，其特征在于，所述的NA3C系统包括缓冲溶液、RNase抑制剂、氯化镁溶液。6.根据权利要求5所述的NA3C系统，其特征在于，所述的缓冲溶液包括Tris
‑
HCl和Cas12a切割缓冲液，Cas12a切割缓冲液组成为：20mM T...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘猛，吴云萍，常洋洋，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：