一种人PKMYT1AR基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明专利技术将检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂应用在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中，人PKMYT1AR基因表达水平高低与非小细胞肺癌临床预后呈负相关性，实验结果显示人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌细胞系中较正常肺上皮细胞表达高；PKMYT1AR基因敲低后，非小细胞肺癌细胞系的增殖受到显著抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期；可明显增加非小细胞肺癌临床铂类化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用；本发明专利技术揭示了PKMYT1AR基因是非小细胞肺癌的潜在风险基因，PKMYT1AR表达抑制与放疗或化疗药物DDP联用，加强非小细胞肺癌的临床治疗效果。效果。效果。

【技术实现步骤摘要】
一种人PKMYT1AR基因及其应用


[0001]本专利技术涉及一种基因及其新用途，尤其是人PKMYT1AR基因及其在肿瘤临床诊断以及药物筛选中的用途，具体涉及人PKMYT1AR基因在非小细胞肺癌临床诊断以及药物筛选中的应用。

技术介绍

[0002]肺癌是一种起源于支气管粘膜或腺体的致命恶性肿瘤，可分为小细胞肺癌(SCLC：small cell lung cancer)和非小细胞肺癌(NSCLC：non
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small cell lung cancer)。SCLC和NSCLC约分别占肺部的20％和80％癌症病例，而NSCLC可以进一步细分为腺癌(LUAD)、鳞状细胞癌(LUSC)和大细胞肺癌。肺癌早期治疗方案是基于手术的综合治疗，多学科治疗在晚期非小细胞肺癌治疗中发挥重要作用，放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗或联合治疗是目前主要的治疗策略。NSCLC的发病率相对较高，近年来，随着诊断和治疗策略的提升，非小细胞肺癌的治疗有了很大的改善，但5年生存率低于17％。因此，仍然有必要研究调节肺癌进展的分子机制，以期发现新的治疗靶点，改善临床结果。
[0003]长链非编码RNA(lncRNA：Long non
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coding RNAs)是超过200个核苷酸且几乎没有蛋白质编码潜力的核苷酸链，虽然这些lncRNA的功能重要性和分子机制还有待进一步研究。LncRNA可通过不同的机制调节肿瘤进展，其中LncRNA作为竞争内源性RNA(ceRNA)的功能，作为"微RNA(miRNA)海绵"消除miRNA介导的对靶向基因的抑制而备受关注。微RNA是一类短(平均18
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25核苷酸)内源性RNA，可以通过与目标mRNA 3'非翻译区(3
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UTR)结合，抑制目标mRNA的稳定性和转化效率从而调节基因表达的RNA。因此，miRNA可以减少抑癌基因的表达，或增加促癌基因表达促进肺癌的发生或进展。基于非编码RNA参与调节化疗或放射治疗敏感性，以及靶向药物的治疗，已经开发了以核酸为基础的策略，要么通过控制lncRNA的表达水平或针对靶向RNA修改原生结构。其中，基于RNA干扰(RNAi)技术和抗顺义寡核苷酸(ASO)被广泛应用。
[0004]越来越多的研究表明，肿瘤干细胞具有干细胞的生物学特性，例如，其有自我更新和分化能力，并与肿瘤的转移和耐药有重要的关系，具有重要的临床意义。然而其潜在的分子机制尚不明确。另外，许多有案可查的发现表明，在肿瘤的进展过程中，lncRNA或miRNA在肿瘤干细胞中发挥着至关重要的作用。分子机制研究发现，在正常干细胞自我更新中发挥重要功能的多条信号通路，如Wnt/b
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catenin、Hedgehog和Notch信号通路等在肿瘤干细胞的干性维持中都发挥了关键作用，并挖掘到了各种肿瘤干细胞的标志物基因，如CD133、CD44、ALCAM and CD90等。
[0005]PKMYT1是一种膜相关酪氨酸/苏氨酸1蛋白激酶，是WEE家族激酶的成员之一，在细胞周期转换过程中抑制Cdk1磷酸化。之后，多项研究发现PKMYT1在不同类型的人类癌症中发挥致癌作用。然而在肺癌中PKMYT1表达如何上调，及其特异的下游靶基因的潜在机制仍然不清楚。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因是长链非编码RNA(lncRNA)。
[0007]本专利技术另一目的是将上述基因应用在非小细胞肺癌临床诊断中，即将检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂应用在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中；人PKMYT1AR基因作为非小细胞肺癌关联基因，应用于非小细胞肺癌检测，检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂是检测人PKMYT1AR基因高表达量的试剂，即将人PKMYT1AR基因高表达作为诊断非小细胞肺癌的标志。
[0008]检测人PKMYT1AR基因表达量可以利用人PKMYT1AR基因序列设计人PKMYT1AR的引物序列，并通过实时定量PCR法检测人PKMYT1AR的RNA的水平；所述引物序列为：
[0009]SEQ ID NO:2：CCACGGCACCAACACTAGTA；
[0010]SEQ ID NO:3：ATCTCAGCACTTTGGGAGGC。
[0011]针对非小细胞肺癌中PKMYT1AR高表达的情况，本专利技术另一目的是将以抑制人PKMYT1AR基因高表达为目的，筛选用于制备治疗非小细胞肺癌的药物。
[0012]针对非小细胞肺癌中人PKMYT1AR高表达的表型，将非小细胞肺癌的作用靶点
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PKMYT1AR基因作为RNA干扰作用靶标，所述RNA干扰作用靶点选自下述核苷酸序列：
[0013]SEQ ID NO:4：GCTTAGCTTCCTCTTGAAGGA；
[0014]SEQ ID NO:5：GCCTTCCTTACGCAGAGAATG。
[0015]将抑制人PKMYT1AR基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA干扰慢病毒，RNA干扰慢病毒感染非小细胞肺癌细胞后，用于筛选非小细胞肺癌治疗药物的细胞系；表达shRNA的序列包括两个靶向人PKMYT1AR基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人PKMYT1AR基因的shRNA靶点序列及其互补序列。
[0016]所述表达shRNA的序列的正义链序列如SEQ ID NO:6所示，反义链序列如SEQ ID NO:7所示；或者正义链序列如SEQ ID NO:8所示和反义链序列如SEQ ID NO:9所示。
[0017]Forward oligo:PKMYT1AR FO1(SEQ ID NO:6)
[0018]CCGGGCTTAGCTTCCTCTTGAAGGACTCGAGTCCTTCAAGAGGAAGCTAAGCTTTTTG；
[0019]Reverse oligo:PKMYT1AR RO1(SEQ ID NO:7)
[0020]AATTCAAAAAGCTTAGCTTCCTCTTGAAGGACTCGAGTCCTTCAAGAGGAAGCTAAGC；或者
[0021]Forward oligo:PKMYT1AR FO2(SEQ ID NO:8)
[0022]CCGGGCCTTCCTTACGCAGAGAATGCTCGAGCATTCTCTGCGTAAGGAAGGCTTTTTG；
[0023]Reverse oligo:PKMYT1AR RO2(SEQ ID NO:9)
[0024]AATTCAAAAAGCCTTCCTTACGCAGAGAATGCTCGAGCATTCTCTGCGTAAGGAAGGC
[0025]将抑制人PKMYT1AR基因表达的ASO序列用于筛选制备非小细胞肺癌治疗的药物，ASO核苷酸序列选自下述序列：
[0026]SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人PKMYT1AR基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.检测权利要求1所述的人PKMYT1AR基因表达量的试剂在制备非小细胞肺癌临床诊断试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：检测人PKMYT1AR基因表达量的试剂是检测人PKMYT1AR基因高表达量的试剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：试剂包括引物，引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。5.以抑制人PKMYT1AR基因表达或敲低人PKMYT1AR基因为目的的筛选用于制备非小细胞肺癌治疗药物的应用。6.根据权利要求5述的应用，其特征在于：将抑制人PKMYT1AR基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA干扰慢病毒，用于筛选非小细胞肺癌治疗药物，表达shRNA的序列包括两个靶向人PKMYT1AR基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人PKMYT1AR基因的shRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨翠萍，陈勇彬，熊秋霞，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：