基于细菌人工染色体的新冠病毒SARS-CoV-2亚基因组复制子克隆、构建及应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及基于细菌人工染色体BAC的新冠病毒SARS

【技术实现步骤摘要】
基于细菌人工染色体的新冠病毒SARS-CoV-2亚基因组复制子克隆、构建及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及基于细菌人工染色体BAC的新冠病毒SARS-CoV-2亚基因组复制子克隆、构建及应用。具体涉及基于细菌人工染色体BAC的带有Gaussia荧光素酶报道基因的新冠病毒(SARS-CoV-2)DNA克隆；可用于体外链接产生病毒亚基因组DNA的，分别含有4个新冠病毒基因片段以及报道基因Gluc的4个DNA克隆；以及通过剔除病毒结构蛋白S，M和E，加入报道基因来构建新冠病毒(SARS-CoV-2)亚基因组复制子的构建策略；本专利技术的系统可用于筛选新冠病毒抗病毒药物。

技术介绍

[0002]针对目前尚缺乏有效的抗新冠病毒(SARS-CoV-2)的药物，相关疫苗作为预防手段，被寄予厚望。虽然目前有多个疫苗正进行临床实验，其免疫效果与保护效果有待证实，以及被寄予厚望的氯喹和瑞德西韦(Remdesivir)治疗效果尚存有诸多争议。因此，在研发疫苗的同时，筛选全新、高效、特异性高的能直接抗病毒的药物仍被迫切期望，而实践中，利用活病毒进行筛选尚需要生物安全三级实验室，其对筛选效率尚存在较大阻碍。
[0003]基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种不使用活新冠病毒的新冠病毒药物筛选系统，以规避对生物安全三级实验室的硬性要求，达到提高筛选效率的效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是基于现有技术的现状，提供一种不使用活新冠病毒的新冠病毒药物筛选系统，以规避对生物安全三级实验室的硬性要求，达到提高筛选效率的效果。具体涉及基于细菌人工染色体BAC的新冠病毒SARS-CoV-2亚基因组复制子克隆、构建及应用。尤其涉及基于细菌人工染色体BAC的带有Gaussia荧光素酶报道基因的新冠病毒(SARS-CoV-2)DNA克隆；可用于体外链接产生病毒亚基因组DNA的，分别含有4个新冠病毒基因片段以及报道基因Gluc的4个DNA克隆；以及通过剔除病毒结构蛋白S，M和E，加入报道基因来构建新冠病毒(SARS-CoV-2)亚基因组复制子的构建策略。
[0005]本专利技术的系统可用于筛选新冠病毒抗病毒药物。
[0006]本专利技术利用本实验室前期分离的新冠病毒nCoV-SH01毒株，通过反向遗传体系，构建了缺失病毒结构蛋白S(spike)，M(membrane protein)和E(envelope protein)，且带有可分泌的Gaussia荧光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)报道基因的亚基因组复制子系统。所述系统经体外转录，产生带报道基因的病毒RNA。病毒RNA经转染入细胞后，起始病毒复制，并导致报道基因Gaussia荧光素酶的表达，分泌到细胞上清。细胞上清的荧光素酶可利用荧光素酶底物进行测定。该复制子系统对瑞德西韦及干扰素敏感，但对丙型肝炎病毒的直接抗病毒药物达拉他韦(DCV)及索非布韦(Sofosbuvir)不敏感，因此该系统可以用于新冠病毒抗病毒药物的筛选和评价。本专利技术在此研究基础上完成。
[0007]具体的，
SH01毒株感染的总细胞RNA，分别得到20个长度约为1.5kb的cDNA片段(图1)，每个片段经过克隆、测序，最后拼接的序列上传NCBI(获取号：MT121215)。本专利技术中利用融合PCR及亚克隆方法，对扩增的20个片段其中的一些片段进行拼接、克隆到制备的克隆载体pLC-Zero-blunt(核酸序列7),得到4个中转质粒pLC-nCoV-A，pLC-nCoV-B，pLC-nCoV-C，pnCoV-D，其中片段A(1-8586nt)，B(8587-15102nt)，C(15103-21562nt)涵盖SARS-CoV-2 nCoV-SH01的ORF1区域(1-21562nt)。
[0032]相关序列如下。
[0033]核酸序列1,SEQ ID NO 1:
[0034]GCGATCGCATCGATAAGCTTATTTAAATCATACCAACATGGTCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAATCTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAACCcAGGAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTCCATTGTTCATTCCACGGACAAAAACAGAGAAAGGAAACGACAGAGGCCAAAAAGCTCGCTTTCAGCACCTGTCGTTTCCTTTCTTTTCAGAGGGTATTTTAAATAAAAACATTAAGTTATGACGAAGAAGAACGGAAACGCCTTAAACCGGAAAATTTTCATAAATAGCGAAAACCCGCGAGGTCGCCGCCCCGTAACCTGTCGGATCACCGGAAAGGACCCGTAAAGTGATAATGATTATCATCTACATATCACAACGTGCGTGGAGGCCATCAAACCACGTCAAATAATCAATTATGACGCAGGTATCGTATTAATTGATCTGCATCAACTTAACGTAAAAGCAACTTCAGACAATACAAATCAGCGACACTGAATACGGGGCAACCTCATGTCGTTAACGTGCCGGCACGGCCTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新冠病毒亚基因组复制子克隆的表达产物，其特征在于，所述的新冠病毒亚基因组复制子克隆的表达产物中，不含有新冠病毒的结构蛋白S、M或者E。2.一种新冠病毒亚基因组复制子克隆，其特征在于，所述的新冠病毒亚基因组复制子克隆剔除结构蛋白S、M和E的核酸序列。3.根据权利要求2所述的新冠病毒亚基因组复制子克隆，其特征在于，所述新冠病毒亚基因组复制子克隆的序列如SEQ ID NO 1或者SEQ ID NO 7所示。4.一种细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求2或者3所述的新冠病毒亚基因组复制子克隆。5.权利要求2所述的新冠病毒亚基因组复制子克隆的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：(1)分离纯化新冠病毒毒株感染的总细胞RNA；(2)将步骤(1)获得的纯化的新冠病毒毒株感染的总细胞RNA进行逆转录和/或扩增；(3)拼接步骤(2)获得的产物所对应的核酸序列；(4)获得涵盖新冠病毒毒株ORF1区域的核酸序列。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括在新冠病毒毒株的ORF1区域之外增加以下序列中的一种或者几种的步骤：启动子序列；荧光素酶的编码序列；Blastinc...

【专利技术属性】
技术研发人员：易志刚，袁正宏，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：