一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种腺相关病毒纯化试剂盒，包括裂解

【技术实现步骤摘要】
一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，更特别地，涉及一种腺相关病毒纯化试剂盒及纯化方法。

技术介绍

[0002]在生物和医学研究和产业化中，转基因技术是重要的研究内容和使用手段，一直处在快速发展中，近年来迅速发展起来的载体病毒技术即是被广泛使用的转基因技术。各种载体病毒的应用已经形成了很大的市场，包括病毒的克隆、包装、制备、纯化等都有市售产品和服务。腺相关病毒(AAV)是常用的载体病毒，已经广泛应用于疫苗、基因治疗以及科研等方面。由于生产和研究的需要，目前，对腺相关病毒的需求量也越来越高。
[0003]目前腺相关病毒的制备和纯化技术相对滞后，由于该病毒包装后仍留在包装细胞里，其纯化过程相对复杂。实验室纯化腺相关病毒的方法主要还是采用超速梯度离心技术，此法首先需要一台超速离心机，而且操作过程繁琐、费时费力。我们与旧金山加州大学Jennifer Whistler博士的实验室合作制备腺相关病毒产品，先后使用了Cell Biolabs公司(美国)和Biominga公司(美国)的腺相关病毒纯化试剂盒，但因其回收率太低而失败。Cell Biolabs和Biomiga的产品类似，均采用树脂吸附法。除此之外，VIRAPUR公司(美国)提供基于过滤膜吸附法的腺相关病毒纯化试剂盒，由于过滤膜吸附法对腺相关病毒吸附的特异性不高，吸附容量有限，纯化效果不是特别好，因此这种产品没有得到广泛使用。已有一些研究者开发了特异性抗体搭载在固体基质上，以提高对AAV的吸附特异性。然而，特异性抗体的使用带来了新的问题，例如在洗脱时难以把AAV颗粒洗下来，造成回收率低，在洗脱过程中还有可能造成抗体与AAV颗粒一起洗脱，影响AAV颗粒纯度。
[0004]因此，需要一种新的腺相关病毒纯化方法和纯化试剂产品。

技术实现思路

[0005]为解决以上问题，本专利技术提供了一种腺相关病毒纯化试剂盒，包括裂解
‑
平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；
[0006]所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和Fc区，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示；
[0007]所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述Fc区的抗体。
[0008]本专利技术通过研发了针对AAV的第一抗体，以及针对第一抗体的第二抗体，并将第二抗体与微珠偶联，从而使得能够快速锚定和洗脱AAV。本专利技术的试剂盒通过离心或磁力的方法进行AAV纯化，大大加快了生产和科学实验中的纯化速度，同时，本专利技术的试剂盒能够提供更高感染滴度的AAV溶液。
[0009]在一个具体实施方案中，所述裂解
‑
平衡缓冲液为pH 8
‑
8.5的tirs缓冲液，含有浓度为0.05％
‑
0.1％的吐温20以及浓度为0.2％
‑
0.3％的NP40。第一抗体与AAV的特异性亲和
力在pH 8
‑
8.5时很高，有利于将AAV锚定在例如微珠等固体基质上。
[0010]在一个具体实施方案中，所述洗脱液为pH 4
‑
5的柠檬酸缓冲液，含有500
‑
100mM的氯化钠。4
‑
5的pH以及50
‑
100mM的氯化钠浓度下有利于从第一抗体洗脱AAV，同时保持第一抗体仍然锚定在微珠上。
[0011]在一个具体实施方案中，所述Fc区是小鼠Fc区。
[0012]在一个具体实施方案中，所述第二抗体为纳米抗体，重链可变区序列如SEQ ID NO:5所示。
[0013]在一个具体实施方案中，所述抗体偶联微珠为琼脂糖微珠或磁珠。
[0014]本专利技术还公开了一种纯化腺相关病毒的方法，包括使用上述腺相关病毒纯化试剂盒纯化腺相关病毒的步骤。
[0015]在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：
[0016]S1：收集含有腺相关病毒的细胞，使用所述裂解平衡缓冲液破碎所述细胞，离心获得含有腺相关病毒的上清液；
[0017]S2：向所述上清液中加入所述第一抗体，混匀，得到第一抗体
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上清液；
[0018]S3：向所述第一抗体
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上清液中加入所述抗体偶联微珠，混匀；
[0019]S4：从所述第一抗体
‑
上清液中分离所述抗体偶联微珠；
[0020]S5：用所述洗脱液从所述抗体偶联微珠洗脱得到腺相关病毒溶液。
[0021]优选地，所述抗体偶联微珠对于所述第一抗体的过量。抗体偶联微珠对第一抗体过量才能将所有与AAV结合的第一抗体固定在微珠上，以防止AAV的损失。
[0022]本专利技术筛选和制备了针对AAV的高特异性和亲和力的抗体，并且该抗体具有特定的pH活性范围，使其容易用于对AAV的分离。利用该AAV抗体的特点制备的AAV纯化试剂盒可通过离心分离(使用琼脂糖微珠)或磁力分离(使用磁珠)的方式快速纯化腺相关病毒，并提高了分离得到的AAV的感染滴度。
附图说明
[0023]图1为ELISA法检测纳米抗体AT1
‑
3对AAV1
‑
8的特异结合能力的统计图。
[0024]图2为纳米抗体AT2对AAV的结合能力随环境pH值的变化曲线。
[0025]图3为第二抗体对小鼠Fc的结合能力随环境pH值的变化曲线。
[0026]图4为破碎上清、分离上清和纯化的AAV溶液中的相对蛋白含量的统计图。
[0027]图5为本专利技术试剂盒与市售试剂盒纯化得到的AAV溶液的基因拷贝数滴度的比较。
[0028]图6为本专利技术试剂盒与市售试剂盒纯化得到的AAV溶液的感染滴度的比较。
具体实施方式
[0029]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0030]1.针对AAV的单克隆抗体的筛选
[0031]将AAV1
‑
13的VP1、VP2和VP3的氨基酸序列进行比对，提取保守序列，合成序列克隆到酵母菌中表达得到AAV外壳蛋白免疫原，将免疫原用来免疫羊驼，取羊驼脾脏进行单克隆抗体筛选。最终，我们筛选到3株对血清型AAV1
‑
8都具有良好的特异性和亲和力的单克隆抗
体(图1)。我们在研究中意外地发现，使用AT2株单克隆抗体对pH特别敏感，在合适的缓冲液中，当pH为7.5
‑
9时，该单克隆抗体对AAV外壳具有非常高的结合力，但是，当pH降低至6以下时该抗体对AAV外壳几乎没有结合力(图2)。通过测序，获得AT2的重链可变区(VHH)序列如SEQ ID NO:1所示，其中，CDR1
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3序列分别如SEQ ID NO:2
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4所示。我们将该VHH与小鼠Fc片段融合表达，得到具有小鼠Fc片段和上述AT2 VHH的新抗体，即为第一抗体。检测第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，包括裂解
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平衡缓冲液、第一抗体、锚定微珠以及洗脱液；所述第一抗体为纳米抗体，具有重链可变区和Fc区，所述重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示；所述抗体偶联微珠为偶联了第二抗体的微珠，所述第二抗体是针对所述Fc区的抗体。2.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述裂解
‑
平衡缓冲液为pH 8
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8.5的tirs缓冲液，含有浓度为0.05％
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0.1％的吐温20以及浓度为0.2％
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0.3％的NP40。3.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为pH 4
‑
5的柠檬酸缓冲液，含有50
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100mM的氯化钠。4.根据权利要求1所述的腺相关病毒纯化试剂盒，其特征在于，所述Fc区是小鼠Fc区。5.根据权利要求4所述的腺相关病毒纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢洪学，王美美，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：