一种犬细小病毒弱毒株感染性克隆及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种犬细小病毒弱毒株感染性克隆及其应用。本发明专利技术将一株CPV

【技术实现步骤摘要】
一种犬细小病毒弱毒株感染性克隆及其应用


[0001]本专利技术属于犬细小病毒(CPV)防控领域，涉及一种犬细小病毒弱毒疫苗株感染性克隆的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]犬细小病毒病是由犬细小病毒感染犬科及其他食肉目动物所导致的烈性、高度传染性疾病，典型临床症状包括白细胞数显著降低、出血性肠炎、剧烈呕吐、快速脱水及心肌炎等，是引起幼犬发病和死亡的重要因素，极大威胁犬类动物的健康。1977年，美国学者Eugster和Nairn率先从患病犬的粪便中分离得到CPV
‑
2，随后新西兰、澳大利亚、比利时、日本等国均报道此病毒的发现。梁士哲等于1982年首先报道发现了疑似CPV
‑
2感染的犬出血性肠炎，次年徐汉坤等确认该病毒的流行。CPV
‑
2在世界范围呈广泛流行，具有与RNA病毒类似的基因组置换率，抗原性连续不断变化，相继出现了CPV
‑
2a、CPV
‑
2b和CPV
‑
2c等多种变异毒株，并且易感宿主范围逐渐扩大。
[0003]CPV
‑
2属于细小病毒属、细小病毒科，是一种单股负链的无包膜DNA病毒，基因组长度约为5.0kb，5
’
和3
’
末端的非编码区均为反向重复序列形成的发夹结构，编码区主要编码两个开放性阅读框(Open reading frame，ORF)ORF1和ORF2，ORF1编码两个非结构蛋白(NS1和NS2)，ORF2编码两个衣壳蛋白(VP1和VP2)。NS1是CPV
‑
2的最主要的非结构蛋白，在细小病毒感染周期中执行多种功能，包括参与病毒基因组复制、病毒及宿主蛋白表达的反式调节，并且涉及参与诱导宿主细胞的自噬及凋亡，是病毒感染引起的细胞毒性的主要影响因子。NS1蛋白的磷酸化属于翻译后修饰，参与调控病毒复制，并影响感染后引起的细胞周期阻滞及细胞毒性。VP2是细小病毒衣壳的主要组成成分，并且是CPV
‑
2的主要抗原蛋白，在控制病毒宿主范围和组织向性方面发挥重要作用。由于VP2蛋白氨基酸的替换不断产生新的抗原变体。
[0004]目前主要通过减毒活疫苗接种措施进行CPV
‑
2的防控。尽管通过该类疫苗能够刺激抗体和细胞介导的免疫反应，但并不能提供针对CPV
‑
2的有效保护性免疫，而造成免疫失败的主要原因之一是CPV
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2不同抗原变体的持续循环，并且由于CPV
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2c是主要流行毒株，基于CPV
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2和CPV
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2b的减毒活疫苗的保护效率降低。
[0005]反向遗传学在病毒学研究中的应用为直接操纵基因修饰病毒提供了操作平台，是研究病毒致病机制、跨种传播及疫苗研发的有效工具。但目前尚未见到通过对CPV的NS1蛋白进行突变从而获得有效的CPV弱毒疫苗株的报道，通过突变获得弱毒性CPV感染性克隆仍较为困难。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种犬细小病毒弱毒株感染性克隆及其应用。
[0007]一种犬细小病毒突变毒株的感染性克隆，该突变毒株的突变位点包括野生型犬细小病毒NS1蛋白第598、601位氨基酸位点(都属于磷酸化位点)中的一个或两个，突变位点上
的氨基酸经突变后替换为不可被磷酸化的氨基酸。
[0008]优选的，所述突变位点还包括野生型犬细小病毒NS1蛋白的其他磷酸化位点(除了上述第598、601位氨基酸位点，例如第584、592、617位氨基酸位点)中的一个或多个。
[0009]优选的，所述突变位点还包括野生型犬细小病毒NS1蛋白的非磷酸化位点中的一个或多个。
[0010]优选的，所述突变位点具体为野生型犬细小病毒NS1蛋白第598和601位氨基酸位点，突变位点上的氨基酸经突变后同时发生替换(例如T598A/T601A)。
[0011]优选的，所述野生型犬细小病毒为CPV
‑
2，例如CPV
‑
2c。
[0012]优选的，所述感染性克隆的核苷酸序列如SEQ.NO.ID.27所示。
[0013]一种突变的犬细小病毒，该突变的犬细小病毒采用上述感染性克隆并经过病毒拯救而得到。
[0014]优选的，所述突变的犬细小病毒的基因组序列如SEQ.NO.ID.27所示。
[0015]上述突变的犬细小病毒在制备犬细小病毒病弱毒疫苗中的应用。
[0016]优选的，所述弱毒疫苗属于减毒活疫苗。
[0017]一种用于病毒拯救的重组质粒，该重组质粒包括上述感染性克隆。
[0018]优选的，所述重组质粒还包括用于连接所述感染性克隆的载体骨架，所述载体骨架采用穿梭质粒(例如低拷贝质粒pKQLL)，确保重组质粒在转染动物细胞(例如F81细胞)前可以在细菌中进行克隆增殖，并避免病毒基因组非编码区的发夹结构无法正确复制的问题。
[0019]本专利技术有益效果体现在：
[0020]本专利技术通过对犬细小病毒流行毒株的NS1蛋白的磷酸化位点进行氨基酸替换，并结合对相应的突变病毒全长基因组感染性克隆的构建、病毒拯救和生物学特性的分析、比较，发现了获得低致病性突变毒株的有效突变位点(第598、601位)和突变方式，所获得的突变毒株(例如CPV
‑2T598A/T601A
)可作为弱毒疫苗的候选毒株，具有良好的应用前景。
附图说明
[0021]图1为CPV
‑
2全长基因组感染性克隆质粒pX
‑
CPV构建流程图(示出了通过无义突变形成的EcoR I遗传标记位点)。
[0022]图2为pX
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CPV的酶切鉴定；图中：泳道1为未酶切的pX
‑
CPV，泳道2为pX
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CPV的BamH I/Xho I双酶切鉴定，泳道3为pX
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CPV的EcoR I单酶切鉴定。
[0023]图3为pX
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CPV转染F81细胞进行病毒拯救中观察到的细胞病变效应(拯救的毒株X
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CPV盲传至第5代时)；图中：Mock为未感染病毒的细胞对照组。
[0024]图4为第5代X
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CPV的EcoR I单酶切鉴定。
[0025]图5为第5代X
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CPV的特异基因组片段测序结果。
[0026]图6为第5代X
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CPV感染细胞后VP2蛋白表达的检测结果；图中：Mock为未感染病毒的细胞对照组，β
‑
actin为内参。
[0027]图7为EcoR I单酶切鉴定X
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CPV携带的遗传标记稳定性的结果图；图中：泳道1为亲本毒株CPV
‑
XY，泳道2为第1代X
‑
CPV，泳道3为第5代CPV
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变的犬细小病毒，其特征在于：该突变的犬细小病毒的突变位点包括野生型犬细小病毒NS1蛋白第598、601位磷酸化位点中的一个或两个。2.根据权利要求1所述一种突变的犬细小病毒，其特征在于：所述突变位点还包括野生型犬细小病毒NS1蛋白的其他磷酸化位点中的一个或多个。3.根据权利要求1所述一种突变的犬细小病毒，其特征在于：所述突变位点还包括野生型犬细小病毒NS1蛋白的非磷酸化位点中的一个或多个。4.根据权利要求1所述一种突变的犬细小病毒，其特征在于：所述突变位点具体为野生型犬细小病毒NS1蛋白第598和601位氨基酸位点。5.根据权利要求1、2、3或4所述一种突变的犬细小病毒，其特征在于：所述突变位点上的氨基酸经...

【专利技术属性】
技术研发人员：童德文，黄勇，苗碧琛，陈松彪，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：