一种橄榄醇合成酶变体M及其用途制造技术

本发明专利技术提供了橄榄醇合成酶变体和表达其的用于生产橄榄醇和橄榄醇酸的工程化微生物，更具体地是一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶变体，所述橄榄醇合成酶变体与其野生型相比的突变是H262M。所述工程化大肠杆菌实现了改善的橄榄醇和橄榄醇酸收率。醇和橄榄醇酸收率。

【技术实现步骤摘要】
一种橄榄醇合成酶变体M及其用途
[0001]本申请是申请日为2021年09月10日和专利技术名称为“橄榄醇合成酶变体和表达其的工程化微生物”的202111058663.5号专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及微生物和酶领域，具体涉及橄榄醇合成酶(OLS)变体和表达其的用于生产橄榄醇(olivetol，OL)和橄榄醇酸(olivetolic acid，OA)的工程化微生物。

技术介绍

[0003]大麻素(cannabinoids)是指来源于植物大麻(Cannabis sativa)的一大类化学分子，种类超过150种。目前国际上使用较多的大麻素包括大麻二酚(cannabidiol，CBD)，四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)和大麻萜酚(cannabigerol，CBG)。CBD是植物大麻中的主要化学成分之一，是大麻素中的非成瘾性成分。THC是大麻中的主要精神活性物质，可成瘾，是在世界各国被严格管制的物质。CBG因其在植物大麻中含量较低，通常被归类为微量大麻素或稀有大麻素，因其为其它大麻素的共同前体，被称为是“大麻素之母”。随着植物大麻的生长，大部分CBG转化为CBD和THC，只有微量的CBG残留在植物体内，供应严重受限，使得CBG应用的发展受到了较大的限制。
[0004]橄榄醇和橄榄醇酸是来源于大麻属(Cannabis)植物的III型聚酮类化合物，具有抗菌，抗肿瘤和抗紫外线等活性，同时也是大麻素的关键生物合成前体。很少有报道从植物天然提取橄榄醇和橄榄醇酸。而且植物种植受诸多因素限制，例如，相比于生物合成更难获得高纯度产品，种植管制严格，产能有限，需要高昂的植物种植和下游提取的投入，生产稳定性较低。橄榄醇和橄榄醇酸的化学合成成本高昂，并且存在环境污染和条件苛刻等问题。而对于橄榄醇和橄榄醇酸的生物合成，根据专利技术人所知，以大肠杆菌为底盘菌来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的产量尚不足以达到产业化的要求。Tan Z等(Tan Z,Clomburg J M,Gonzalez R.Synthetic pathway for the production of olivetolic acid in Escherichia coli[J].ACS synthetic biology,2018,7(8):1886
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1896.)报道了在500mL生物反应器中橄榄醇酸的产量仅为80mg/L。2020年，专利号为WO2020176547A1的专利报道了，通过筛选来源于Cymbidium hybrid cultivar的橄榄醇合酶，测试发现橄榄醇的产量为40.7mg/L。
[0005]本领域仍然需要以高收率来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的新型微生物。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过提供以高收率来生物合成橄榄醇和橄榄醇酸的橄榄醇合成酶(OLS)变体而满足了本领域的上述需要。根据本专利技术的工程化微生物能够在小规模培养下产生高浓度的橄榄醇和橄榄醇酸，而且由于小规模培养时发酵液的细胞浓度远低于工业化培养时发酵液的细胞浓度，可以预期本专利技术的工程化微生物具有强大的橄榄醇和橄榄醇酸工业化生产潜力，有利于大麻素的工业化生物合成。
[0007]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种工程化大肠杆菌，其中所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇合成酶(OLS)变体，其中所述OLS变体与其野生型相比包含选自以下突变中的一种或多种：I303T、I52L、S56A、H262M和K263R。
[0008]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇酸环化酶(OAC)。
[0009]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的基因组fabH基因被缺失。
[0010]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的基因组fadE基因被缺失。
[0011]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌的基因组fabH和fadE基因两者被缺失。
[0012]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌被修饰以过表达长链酯酰辅酶A合成酶(fadD)。
[0013]在所述方面的一些实施方式中，所述工程化大肠杆菌是从野生型大肠杆菌、BW25113或BL21修饰而来。
[0014]在所述方面的一些实施方式中，所述修饰是通过引入质粒来进行。
[0015]在所述方面的一些实施方式中，所述OLS和OAC通过同一质粒来表达。
[0016]在所述方面的一些实施方式中，所述fadD通过质粒来过表达。
[0017]在另一个方面，本专利技术提供了一种用于制备工程化大肠杆菌的方法，其包括修饰大肠杆菌以表达橄榄醇合成酶(OLS)变体，其中所述OLS变体与其野生型相比包含选自以下突变中的一种或多种：I303T、I52L、S56A、H262M和K263R。
[0018]在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括修饰所述大肠杆以表达橄榄醇酸环化酶(OAC)。
[0019]在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括使所述大肠杆菌的基因组fabH基因缺失。
[0020]在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括使所述大肠杆菌的基因组fadE基因缺失。
[0021]在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括使所述大肠杆菌的基因组fabH和fadE基因两者缺失。
[0022]在所述方面的一些实施方式中，所述方法包括修饰所述大肠杆菌以过表达长链酯酰辅酶A合成酶(fadD)。
[0023]在所述方面的一些实施方式中，所述大肠杆菌是野生型大肠杆菌、BW25113或BL21。
[0024]在所述方面的一些实施方式中，所述修饰是通过引入质粒来进行。
[0025]在所述方面的一些实施方式中，所述OLS和OAC通过同一质粒来表达。
[0026]在所述方面的一些实施方式中，所述fadD通过质粒来过表达。
具体实施方式
[0027]除非另外指出，否则本专利技术的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和合成生物学等等的常规技术，其在本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的解释：“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”第二版(Sambrook
等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编,1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编,1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编，1987，以及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction,”(Mullis等人编,1994)；Singleton等人，Dictionary of Microbiology a本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种橄榄醇合成酶变体，其特征在于，所述橄榄醇合成酶变体与SEQ ID NO:13所示的野生型橄榄醇合成酶相比的突变是H262M。2.一种编码权利要求1所述橄榄醇合成酶变体的基因。3.一种包括权利要求2所述基因的重组表达载体。4.一种工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达权利要求1所述的橄榄醇合成酶变体，且所述工程化大肠杆菌的SEQ ID NO:3所示的基因组fabH基因和/或SEQ ID NO:6所示的基因组fadE基因被缺失。5.根据权利要求4所述的工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌被修饰以表达橄榄醇酸环化酶。6.根据权利要求5所述的工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜德尧，王高艳，张倩，宗朕，李明月，邱悦悦，尹进，张浩千，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：