突变的PGLB寡糖基转移酶制造技术

本公开提供了突变的PglB寡糖基转移酶，其具有有效催化糖从脂质载体转移到蛋白质上糖基化基序中的天冬酰胺残基的能力。还提供了编码突变的PglB寡糖基转移酶的多核苷酸、能够表达工程化的PglB寡糖基转移酶的宿主细胞以及使用工程化的PglB寡糖基转移酶制备N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】突变的PGLB寡糖基转移酶
专利

[0001]本专利技术涉及改进的PglB寡糖基转移酶及其在蛋白质的糖基化和/或与糖链缀合的载体蛋白的产生中的用途。本专利技术还包括编码改进的PglB寡糖基转移酶的多核苷酸和包含所述多核苷酸的宿主细胞。
[0002]专利技术背景
[0003]糖结合疫苗因其预防许多危及生命的细菌感染的能力而得到广泛认可。糖结合疫苗通常被认为是有效和安全的，并且已经在人类中使用了30多年。常规的糖疫苗生产通常涉及用病原菌的多糖抗原对免疫原性载体蛋白进行化学修饰。然而，最近，出现了用于生产糖结合疫苗的生物技术方法，这有望降低生产成本并进一步提高糖结合疫苗制剂的均质性以及可能的效力和安全性。
[0004]在真核细胞中，N
‑
连接糖基化是涉及多种酶的关键翻译后蛋白质修饰机制。在原核细胞中，N
‑
连接糖基化由某些细菌N
‑
寡糖基转移酶(N
‑
OST)催化。空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的蛋白质糖基化基因簇包括PglB基因，该基因编码膜结合的N
‑
OST(PglB
Cj
)。PglB可以在标准细菌宿主，例如，大肠杆菌(E.coli)中表达，并且可以糖基化共表达的周质蛋白，这些蛋白携带至少一个表面暴露的D/E
‑
Z1‑
N
‑
Z2‑
S/T(Z1和Z2≠P)糖基化基序。PglB可以将细菌多糖抗原转移到某些空肠弯曲杆菌蛋白以及其他含有工程化的糖基化位点的生物体的免疫原性载体蛋白上。PglB可以转移寡糖，并在一定程度上转移革兰氏阴性菌的O
‑
抗原脂多糖结构和革兰氏阳性菌的荚膜抗原多糖。然而，PglB的寡糖基转移酶活性的效率可以根据糖与含有所需共有序列的蛋白质共价结合的性质而变化。因此需要改进的PglB蛋白，其能够催化具有与在空肠弯曲杆菌中转移的那些不同的结构的糖类的有效转移至含有所需糖基化基序的蛋白质。
[0005]本公开提供了工程化的PglB寡糖基转移酶，其已被修饰以在转移一系列未转移到空肠弯曲杆菌细胞中的蛋白质的糖时提高PglB的效率。
[0006]因此，提供了包含与SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的PglB寡糖基转移酶(OST)多肽或其功能片段，其中PglB寡糖基转移酶多肽氨基酸序列包含以下特征：至少一个选自于氨基酸57、63、94、101、176、191、193、233、234、286、301、319、397、402、435、446、462、479、523、532、605、610、645、676和695的残基被置换为与在SEQ ID NO：1或2中该位置处发现的氨基酸不同的氨基酸。在优选的实施方式中，氨基酸序列与SEQ ID NO：2至少90％相同。
[0007]在第二实施方式中，提供了编码本专利技术的突变的PglB寡糖基转移酶多肽的多核苷酸。
[0008]在第三实施方式中，提供了包含至少一种本专利技术的PglB寡糖基转移酶或编码至少一种本专利技术的PglB OST的多核苷酸的组合物或宿主细胞(例如，原核宿主细胞或大肠杆菌宿主细胞)。
[0009]在第四实施方式中，提供了用于制备糖基化蛋白的方法，包括以下步骤：
[0010](a)在适合生产蛋白质的条件下培养包含本专利技术的PglB和/或编码本专利技术的PglB
的多核苷酸的本专利技术的宿主细胞；和
[0011](b)从宿主细胞中分离糖基化蛋白。
[0012]在第五实施方式中，提供了用于制备糖基化蛋白的体外方法，包括以下步骤；
[0013]i)将以下混合在一起：
[0014]a)本专利技术的PglB寡糖基转移酶；
[0015]b)包含至少一个糖基化共有序列的蛋白质，所述糖基化共有序列包含氨基酸序列Asp/Glu
‑
Z1‑
Asn
‑
Z2‑
Ser/Thr，其中Z1和Z2可以是除Pro之外的任何天然氨基酸；和
[0016]c)被PglB识别的脂质载体上的糖链；
[0017]ii)在适合PglB的酶促活性的条件下孵育以将糖链转移至蛋白质的该至少一个糖基化共有序列，从而获得糖基化蛋白；和
[0018]iii)分离糖基化蛋白。
[0019]在第六实施方式中，提供了通过本专利技术的方法制备的糖基化蛋白。
[0020]在第七实施方式中，提供了本专利技术的PglB寡糖基转移酶或其功能片段在生产其中糖连接至糖基化共有序列的N残基的糖基化蛋白中的用途，所述糖基化共有序列包含氨基酸序列Asp/Glu
‑
Z1‑
Asn
‑
Z2‑
Ser/Thr，其中Z1和Z2可以是蛋白质的除Pro之外的任何天然氨基酸，从而形成糖基化蛋白。
[0021]附图简述
[0022]图1
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当将肺炎链球菌(S.pneumoniae)血清型8的荚膜糖转移至蛋白质时，PglB中的突变导致更高的寡糖基转移酶活性。图A显示了当使用来自第1、2、3、4、5、6和7轮的PglB将肺炎链球菌的荚膜糖转移到EPA载体蛋白时，产量的复合倍数增加。图B显示蛋白质印迹和考马斯染色的凝胶，其表明在不同轮次的突变后，用肺炎链球菌血清型8糖进行糖基化的EPA的增加。图C显示考马斯染色的凝胶和用抗肺炎链球菌血清型8抗体探测的蛋白质印迹，其证明在使用点突变的PglB
Cj
进行生物偶联后，含有肺炎链球菌血清型8糖的偶联物的产生增加。
[0023]图2
‑
突变的PglB还具有增加的将肺炎链球菌血清型22F转移到蛋白质的活性。图A显示ELISA结果，其显示第3、4和5轮PglB在将肺炎链球菌血清型22F的荚膜糖转移到蛋白质的活性增加。图B显示了第3、4和5轮的PglB的用血清型22F荚膜糖糖基化的EPA产量增加的蛋白质印迹结果。
[0024]图3
–
突变的PglB具有提高的将肺炎链球菌血清型23A和35B转移到蛋白质的活性。图A显示考马斯凝胶和蛋白质印迹的结果，其显示当使用第4、5和7轮PglB催化转移时，EPA用肺炎链球菌血清型23A多糖的糖基化的增加。图B显示与使用野生型PglB相比，当使用第3轮的PglB转移肺炎链球菌血清型35B的荚膜糖时，EPA的糖基化增加。
[0025]图4
–
突变的PglB具有提高的将肺炎链球菌血清型19A转移到蛋白质的活性。用肺炎链球菌血清型19A糖基化的EPA量的考马斯蓝和蛋白质印迹结果，其使用：泳道1
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失活的PglB，泳道2
‑
含有Y77R、N311V和H479M突变的PglB，泳道3
–
第6轮PglB，泳道4
‑
10
–
各种第7轮PglB突变。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含与SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的PglB寡糖基转移酶(OST)多肽或其功能片段，其中所述PglB寡糖基转移酶多肽氨基酸序列包括以下特征：至少一个选自于氨基酸X57、X63、X94、X101、X172、X176、X191、X193、X233、X234、X255、X286、X295、X301、X319、X397、X402、X425、X435、X446、X462、X479、X523、X532、X601、X605、X606、X610、X645、X676和X695的残基被置换为与在SEQ ID NO：1中该位置处发现的氨基酸不同的氨基酸。2.如权利要求1所述的PglB寡糖基转移酶多肽或其功能片段，其中对应于SEQ ID NO：1的氨基酸57的残基被突变为R或K或T，优选为R或T，更优选为R。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的PglB寡糖基转移酶多肽或其功能片段，其中所述PglB寡糖基转移酶多肽氨基酸序列包括以下特征：至少一个选自于氨基酸X78、X84、A155、X293、X300、X301、X306、X308、X462、X464、X479、X523和X570的残基被置换为与在SEQ ID NO：1中该位置处发现的氨基酸不同的氨基酸。4.如权利要求3所述的PglB OST多肽或其功能片段，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自于以下的特征：X78突变为T；X84突变为W；X155突变为Q；X293突变为C；X300突变为L；X301突变为P或G；X306突变为H；X308突变为W；X462突变为W、N或T；X464突变为L；X479突变为M；X523突变为R；X570突变为R或V。5.如权利要求3
‑
4中任一项所述的PglB OST，其中所述氨基酸序列包括至少一个选自于以下的特征：对应于SEQ ID NO：1的氨基酸X301的残基突变为P；对应于SEQ ID NO：1的氨基酸X462的残基突变为N或W，以及对应于SEQ ID NO：1的氨基酸X479的残基突变为M。6.如权利要求3
‑
5中任一项所述的PglB OST，其包含至少2、3、4、5或6个以下特征：对应于SEQ ID NO：1的X300的氨基酸突变为L；对应于SEQ ID NO：1的X301的氨基酸突变为P，对应于SEQ ID NO：1的X308的氨基酸突变为W，对应于SEQ ID NO：1的X462的氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：葛兰素史克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：