皂苷的修饰制造技术

用于皂苷的酶促修饰的方法、由此制备的产品、所述产品的用途以及其他相关方面。所述皂苷可以是皂皮树属(Quillaja)物种的提取物，如皂树(Quillaja saponariaMolina)的提取物。saponariaMolina)的提取物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】皂苷的修饰


[0001]本申请总体上涉及皂苷，尤其是用于皂苷的酶促修饰的方法、由此制备的产品、所述产品的用途以及其他相关方面。本申请进一步涉及葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，尤其是突变的葡萄糖苷酶和鼠李糖苷酶，其可用于皂苷的酶促修饰的方法中。皂苷可获自皂皮树属(Quillaja)物种，包括可获自皂皮树属物种的提取物，例如皂树(Quillaja saponaria Molina)的提取物。

技术介绍

[0002]皂苷是类固醇或萜类糖苷。它们具有广泛的用途，从灭火器泡沫到食品添加剂和免疫增强剂(Reichert,2019)。
[0003]皂皮树属提取物(E 999)目前已根据欧盟法规1129/2011获得欧洲食品安全局的批准，作为调味饮料(14.1.4)、苹果酒和梨酒(14.2.3)中的食品添加剂。皂皮树属提取物(E 999)被描述为通过皂树或其他皂皮树属物种的磨碎内树皮或木材的水提法获得。它也被描述为含有许多由皂皮酸的苷组成的三萜皂苷。认为还含有糖——包括葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖—以及单宁、草酸钙和其他微量组分。(EFSA Journal 2019 17(3):5622)
[0004]几十年来，皂苷作为免疫刺激剂一直受到关注(参见，例如，Hyslop,1969)。Quil A是一种皂苷级分，来源于皂树树皮的水提物(Dalsgaard,1974)。Quil A本身含有多种组分，其中四种最主要的Quil A级分通过反相色谱纯化，即QS
‑
7、QS
‑
17、QS/>‑
18和QS
‑
21，尽管溶血活性和毒性各不相同，但均具有免疫刺激活性(Kensil,1991；Kensil,1995)。主要的皂苷级分QS
‑
18被发现对小鼠具有高毒性，但皂苷级分QS
‑
7和QS
‑
21的毒性要小得多。QS
‑
21比QS
‑
7更丰富，是研究最广泛的皂苷佐剂(Ragupathi,2011)。
[0005]皂树树皮水/甲醇提取物的液相色谱/质谱分析揭示了100多种皂苷，其中许多已指定结构(Nyberg,2000；Nyberg,2003；Kite,2004)。
[0006]已经描述了柳叶皂皮树(A St.
‑
Hil&Tul)Mart.提取物，其中各种组分的特性通过质谱法确定。柳叶皂皮树(Quillaja brasiliensis)提取物中的许多皂苷组分对应于皂树提取物中发现的皂苷(WWallace,2017；Wallace,2019)并且还显示柳叶皂皮树提取物具有免疫刺激作用(Cibulski,2018；Yendo,2017)。
[0007]佐剂系统01(AS01)是基于脂质体的佐剂，其包含两种免疫刺激剂，3
‑
O
‑
脱酰基
‑4’‑
单磷酰基脂质A(3D
‑
MPL)和QS
‑
21(Garcon,2011；Didierlaurent,2017)。3D
‑
MPL是明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)脂多糖的无毒衍生物。AS01包含在疟疾疫苗(RTS，S
‑
Mosquirix
TM
)和带状疱疹疫苗(HZ/su
‑
Shingrix
TM
)以及多种候选疫苗中。AS01注射导致动物模型中先天免疫的快速和瞬时激活。中性粒细胞和单核细胞在免疫后迅速募集到引流淋巴结(dLN)。此外，AS01诱导MHCII
高
树突状细胞(DC)的募集和激活，这是T细胞激活所必需的(Didierlaurent,2014)。对于AS01组分的作用机制也有一些数据可用。3D
‑
MPL通过TLR4发出信号，刺激NF
‑
KB转录活性和细胞因子的产生，并直接激活人类和小鼠的抗原呈递细胞
(APC)(De Becker,2000；Ismaili,2002；Martin,2003；Mata
‑
Haro,2007)。QS
‑
21在小鼠中促进高抗原特异性抗体反应和CD8
+ T细胞反应(Kensil,1998；Newman,1992；Soltysik,1995)和人类的抗原特异性抗体反应(Livingston,1994)。由于其物理特性，人们认为QS
‑
21可能在体内充当危险信号(Lambrecht,2009；Li,2008)。尽管QS
‑
21已被证明可以激活ASC
‑
NLRP3炎症小体和随后的IL
‑
1β/IL
‑
18释放(Marty
‑
Roix,2016)，参与皂苷的佐剂作用的确切分子途径尚待明确。
[0008]皂树的提取物是市售的，包括具有不同纯度的级分，例如Quil A、级分A、级分B、级分C、QS
‑
7、QS
‑
17、QS
‑
18和QS
‑
21。
[0009]在开发质量控制方法以提供降解的参考样品的过程中，已经描述了通过Revelation Aroma对Quil
‑
A的酶促水解(Lecas,2021)。
[0010]皂苷的可获得性受到限制，尤其是那些从稀有植物中获得的皂苷或其中感兴趣的皂苷以相对低的量存在的情况下。此外，将某些皂苷与其他组分(尤其是可能具有相似结构的其他皂苷组分)分离可能很麻烦。因此，仍然需要可以提高感兴趣的皂苷的产量和/或促进去除不需要的皂苷组分的新方法。
[0011]海洋贫养杆菌(Modestobacter marinus)葡萄糖苷酶(Uniparc参考号UPI000260A2FA，Uniprot参考号I4EYD5)是一种天然存在的葡萄糖苷酶。仍然需要具有改进性质的进一步的葡萄糖苷酶。
[0012]黄色克雷伯氏菌(Kribbella flavida)鼠李糖苷酶(Uniparc参考号UPI00019BDB13，Uniprot参考号D2PMT)是一种天然存在的鼠李糖苷酶。仍然需要具有改进性质的进一步的鼠李糖苷酶。

技术实现思路

[0013]本专利技术提供了一种制备产物皂苷的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本专利技术的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
[0014]还提供了增加组合物中产物皂苷量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本专利技术的多肽，例如工程化的葡萄糖苷酶多肽或工程化的鼠李糖苷酶多肽。
[0015]还提供了减少组合物中起始皂苷量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。合适地，该方法使用本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种制备产物皂苷的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为所述产物皂苷的步骤。2.一种增加组合物中产物皂苷的量的方法，所述方法包括将起始皂苷酶促转化为所述产物皂苷的步骤。3.一种降低组合物中起始皂苷的量的方法，所述方法包括将所述起始皂苷酶促转化为产物皂苷的步骤。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷是皂皮酸糖苷。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述起始皂苷可从皂树获得。6.如权利要求5所述的方法，其中所述起始皂苷从皂树获得的。7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是QS
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18家族组分。8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是去葡糖基
‑
QS
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17家族组分。9.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是QS
‑
17家族组分。10.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是去阿拉伯呋喃糖基
‑
QS
‑
18家族组分。11.如权利要求5或6所述的方法，其中所述起始皂苷是乙酰化的去葡糖基
‑
QS
‑
17家族组分。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷可从皂树获得。13.如权利要求7、8或12中任一项所述的方法，其中所述产物皂苷是QS
‑
21家族组分。14.如权利要求9或12所述的方法，其中所述产物皂苷是QS
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18家族组分。15.如权利要求9或12所述的方法，其中所述产物皂苷是去葡糖基QS
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17家族组分。16.如权利要求10或12所述的方法，其中所述产物皂苷是去阿拉伯呋喃糖基
‑
QS
‑
21家族组分。17.如权利要求11或12所述的方法，其中所述产物皂苷是乙酰化的QS
‑
21家族组分。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中单一起始皂苷被转化为单一产物皂苷。19.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中多种起始皂苷被转化成多种产物皂苷。20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中通过从植物材料中提取获得所述起始皂苷。21.如权利要求20所述的方法，其中通过水提取获得所述起始皂苷。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括通过葡萄糖苷酶去除β
‑
葡萄糖残基。23.如权利要求22所述的方法，其中所述葡萄糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ IDNo.262、208、63、229、250、5、101、207、169、247、302、324、319、9、240、325、338、850、879、868、826、804、888、881、891、816、827、857、853、842、814、886、885、838、829、808、828、870、873、844、882、874、825、824、823、810、894、849、803、890、841、832、830、845、871、837、883或809的氨基酸序列，或其功能变体。24.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述酶促转化包括通过鼠李糖苷酶去除α
‑
鼠李糖残基。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述鼠李糖苷酶包含以下，例如由以下组成：根据SEQ IDNo.992、1003、1052、1073、1017、1055、1075、1001、1007、1061、1079、1027、1039、10...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：葛兰素史克生物有限公司，
类型：发明
国别省市：