一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，且公开了一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成，具体是将烟酰胺磷酸核糖转移酶与核糖磷酸焦磷酸激酶通过连接肽组合成一个融合酶。该融合酶基因可以转化到大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中，以该菌作为菌种，烟酰胺为底物，发酵生产烟酰胺单核苷酸；或者在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中表达后，提取纯化该融合酶，在体外转化生产烟酰胺单核苷酸，本发明专利技术的融合酶能够显著提高烟酰胺单核苷酸的生产效率。的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用。

技术介绍

[0002]心血管疾病是现代社会对人类健康和生命威胁最大的一类疾病。同时，常见的老年疾病和症状，如阿尔茨海默病、骨质疏松、肌肉减少以及肝脏的功能减退都与毛细血管的减少有关。研究发现，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+，也称辅酶I)是一个关键的物质，在动物和人类中的正常年龄增长中，nad+在细胞中的生物可利用度及相关代谢程度是逐步下降的，进而造成生理衰老。
[0003]多项研究开始探索通过提升体内nad+的活力来延缓衰老。一个nad+的前体物质，烟酰胺单核苷酸(NMN)表现出非常好的前景。在动物模型试验中，口服补充烟酰胺单核苷酸(NMN),能够改善动物的多种生理功能，包括改善心血管功能。还有研究发现，中年小鼠口服烟酰胺单核苷酸作为抗衰老补充剂，能够延长寿命长达29％。除了在保健抗衰老方面的应用，研究也发现，NMN在一些具体疾病的治疗中也有良好表现。在这个老龄化日益严重的社会背景下，烟酰胺单核苷酸有难以估量的市场容量。
[0004]烟酰胺单核苷酸的一个体内合成途径是在烟酰胺磷酸核糖转移酶的作用下，烟酰胺和5
‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸(PRPP)反应生成烟酰胺单核苷酸。5
‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸则是在核糖磷酸焦磷酸激酶的作用下，由5
‑
磷酸核糖和ATP反应而得。因此，构建一个烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，将有利于生成的PRPP进一步与烟酰胺反应得到烟酰胺单核苷酸。
[0005]目前，烟酰胺单核苷酸的来源主要为微生物发酵法和体外酶法转化来进行生产。体外酶法转化需要收集纯化所需的酶制剂，且需要使用酶转化反应的各种底物，底物成本较高；构建融合酶，能够简化酶制剂的收集纯化，提高反应效率。微生物发酵法只需使用烟酰胺作为反应底物，成本低，但目前所报道的大肠杆菌发酵法和和酵母发酵法获得的产品得率较低，只有不到16mg/L发酵液，达不到商业化生产要求。先前研究表明，与含烟酰胺磷酸核糖转移酶单顺反子的大肠杆菌相比，含烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶双顺反子的大肠杆菌并不能显著提高烟酰胺单核苷酸的表达量。因此，构建含融合酶的重组菌株有望提高利用微生物发酵法生产烟酰胺单核苷酸的产量。
[0006]本专利技术通过选择合适的连接肽构建烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，成功提高了重组菌株烟酰胺单核苷酸的表达量。融合酶在体外酶转化生产烟酰胺单核苷酸也有其优势。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，利用优选的连接肽构建烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，将融合酶基因转入宿主细胞，利用重组宿主细胞发酵生产烟酰胺单核苷酸；或者利用宿主细胞
发酵生产融合酶，然后利用融合酶在体外转化生产烟酰胺单核苷酸，解决了上述
技术介绍
中所提出的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成。
[0009]所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]所述的核糖磷酸焦磷酸激酶来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，其序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]所述的连接肽为10
‑
50个氨基酸的多肽，其中的优选序列如序列表SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
[0012]优选的，所述工艺步骤如下：
[0013]1)构建由常用的宿主启动子和编码权利要求书1所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
[0014]2)在培养基中加入0.1％
‑
2％烟酰胺，以常规的发酵工艺发酵生产烟酰胺单核苷酸。
[0015]优选的，所述工艺步骤如下：
[0016]1)构建由常用的宿主启动子和编码所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
[0017]2)以常规的发酵及纯化工艺发酵生产所述的融合酶；
[0018]3)利用已公开的方法，以烟酰胺，核糖和ATP为原料，在上述的融合酶的催化作用下，反应制得烟酰胺单核苷酸。
[0019]有益效果如下：
[0020]该生产烟酰胺单核苷酸的融合酶及其应用，首次成功构建一个性能优良的烟酰胺磷酸核糖转移酶和核糖磷酸焦磷酸激酶的融合酶，此融合酶在微生物法或体外合成法生产烟酰胺单核苷酸中都可以得到应用；与含烟酰胺磷酸核糖转移酶基因或者含烟酰胺磷酸核糖转移酶基因和核糖磷酸焦磷酸激酶基因双顺反子的宿主菌相比，含新构建的融合酶基因的宿主菌能够提高50％以上的烟酰胺单核苷酸产量。应用于体外酶转化生产烟酰胺单核苷酸中，融合酶也能简化酶生产纯化的工艺，提高酶转化效率。
具体实施方式
[0021]基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1
[0023]本实例将由来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因、连接肽和来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的核糖磷酸焦磷酸激酶构成的融合酶表达元件克隆到大肠杆菌表达质粒pSE380。
[0024]构建重组质粒pSE380
‑
NL1P
[0025]人工合成如下DNA片断：
[0026][0027][0028][0029]将合成的DNA片段和质粒pSE380用限制性内切酶EcoR I和Pst I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5
ɑ
感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380
‑
NL1P。
[0030]2.构建重组质粒pSE380
‑
NL2P
[0031]人工合成如下DNA片断：
[0032][0033]将合成的DNA片段和质粒pSE380
‑
NL1P用限制性内切酶Kpn I和Sal I进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5
ɑ
感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pSE380
‑
NL2P。
[0034]构建重组质粒pSE380
‑
NL3P
[0035]人工合成如下DNA片断：
[0036][0037]将合成的DNA片段和质粒pS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产烟酰胺单核苷酸的融合酶，其特征在于：其氨基酸序列由烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及一个连接肽组合而成；所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于杜克雷嗜血杆菌；所述的核糖磷酸焦磷酸激酶来源于解淀粉芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：工艺步骤如下：S1、构建由常用的宿主启动子和编码所述的融合酶的基因构成的基因表达单元，并导入宿主细胞大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；S2、在培养基中加入0.1％
‑
2％烟酰胺，以常规的发酵工艺发酵生产烟酰胺单核苷酸。3.根据权利要求1所述的一种生产烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：工艺...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓明，韦航，李丛，卢运琨，周志强，梁树华，陆迪，于春娇，
申请(专利权)人：南宁邦尔克生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：