一种利用重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法。具体是将烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件整合到优化改造后的枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，使用优化后的培养基，加入烟酰胺为底物，发酵生产烟酰胺单核苷酸。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术利用食品安全的表达系统生产烟酰胺单核苷酸，整合型表达的重组菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，使用优化后的重组菌株和培养基，烟酰胺单核苷酸产量高于其他文献报道的水平。

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法
本专利技术属于生物
，具体是一种重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法。
技术介绍
心血管疾病是现代社会对人类健康和生命威胁最大的一类疾病。同时，常见的老年疾病和症状，如阿尔茨海默病、骨质疏松、肌肉减少以及肝脏的功能减退都与毛细血管的减少有关。研究发现，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+，也称辅酶I)是一个关键的物质，在动物和人类中的正常年龄增长中，nad+在细胞中的生物可利用度及相关代谢程度是逐步下降的，进而造成生理衰老。多项研究开始探索通过提升体内nad+的活力来延缓衰老。一个nad+的前体物质，烟酰胺单核苷酸(NMN)表现出非常好的前景。在动物模型试验中，口服补充烟酰胺单核苷酸(NMN),能够改善动物的多种生理功能，包括改善心血管功能。还有研究发现，中年小鼠口服烟酰胺单核苷酸作为抗衰老补充剂，能够延长寿命长达29％。除了在保健抗衰老方面的应用，研究也发现，NMN在一些具体疾病的治疗中也有良好表现。在这个老龄化日益严重的社会背景下，烟酰胺单核苷酸有难以估量的市场容量。目前，烟酰胺单核苷酸的来源主要为化学合成。化学合成的方法操作较为困难，耗时长、成本高、收率低，难以实现工厂化大规模生产。近来，有研究开发使用微生物发酵法和体外酶法转化来进行生产。体外酶法转化需要收集纯化所需的酶制剂，且需要使用酶转化反应的各种底物，底物成本较高；微生物发酵法只需使用烟酰胺作为反应底物，成本低，但目前所报道的大肠杆菌发酵法和和酵母发酵法获得的产品得率较低，只有不到16mg/L发酵液，达不到商业化生产要求。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品级的安全微生物，已被广泛应用于酶制剂等生物制品的生产。本专利技术通过酶基因克隆及改造、代谢通路优化等手段改造枯草芽孢杆菌作为细胞工厂，高效发酵生产烟酰胺单核苷酸。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法。利用整合质粒将烟酰胺磷酸核糖转移酶基因表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，转化烟酰胺得到烟酰胺单核苷酸。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：1.构建一种能够以整合型的方式表达烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，具体方法为：将烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；上述烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件包含能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子和烟酰胺磷酸核糖转移酶基因；上述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；上述烟酰胺磷酸核糖转移酶基因来源于红色亚栖热菌(Meiothermusruber)或杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)；枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒；宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168或转酮酶基因缺失的枯草芽孢杆菌168衍生菌株。2.利用上述一种能够以整合型的方式表达表达烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组枯草芽孢杆菌生产烟酰胺单核苷酸的方法，工艺步骤如下：1)一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的LB平板上接上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml液体培养基中，于37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；2)二级种的制备：将一级种接种于800ml液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右，时间为4～5小时；3)三级种的制备：将二级种接种到80L液体发酵罐中，在37℃条件下，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD600为0.6左右，时间为5～6小时；4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，加入0.1％-1％烟酰胺的液体培养基，在36～38℃条件下，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控pH6～8,培养24～48小时,破胞后分离纯化可得烟酰胺单核苷酸产品；上述液体培养基为基础盐培养基，具体成分为：每升培养基包含7g磷酸氢二钾，2g磷酸二氢钾，0.5g柠檬酸钠，0.1g硫酸镁，1g硫酸铵，10g葡萄糖。本专利技术首次将烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件整合到优化改造后的枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，使用优化后的培养基，加入烟酰胺为底物，发酵生产烟酰胺单核苷酸。本专利技术的优点是：本专利技术利用食品安全的表达系统生产烟酰胺单核苷酸，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，表达的烟酰胺单核苷酸超过200ug/ml，远高于其他文献报道的水平。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本专利技术要求保护范围的限制。实施例1本实例将由来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)重叠启动子P43启动子和来源于杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因构成的烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83。1.构建重组质粒pMLK83-P43根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5’attgctggacgcttatggac3’和下游引物为5’cgggatccattcctctcttacctataat3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(枯草芽孢杆菌1A751总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTARBuffer20ul，10pmol/uldNTP2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ulPrimeSTARHSDNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamHI、HindIII分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43。2.构建重组质粒pMLK83-P43-hdNadV人工合成如下DNA片断：将合成的DNA片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamHI和SacII进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-p43-hdNadV。实施例2本实例将由来源于来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能够以整合型的方式表达烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：/n将烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；/n所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件包含能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子和烟酰胺磷酸核糖转移酶基因；/n所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；/n所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；/n所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因来源于红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)或杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)；/n所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83；/n所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168或转酮酶基因缺失的枯草芽孢杆菌168衍生菌株。/n...

【技术特征摘要】
20200525 CN 20201044922501.一种能够以整合型的方式表达烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：
将烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；
所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶表达元件包含能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子和烟酰胺磷酸核糖转移酶基因；
所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；
所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；
所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶基因来源于红色亚栖热菌(Meiothermusruber)或杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)；
所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pML...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓明，韦航，梁树华，卢运琨，李丛，周志强，韦旭钦，陆迪，
申请(专利权)人：南宁邦尔克生物技术有限责任公司，南宁市拜欧生物工程有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广西;45