用于NT-proBNP定量的高灵敏度颗粒增强测定制造技术

可使用至少一种抗体在生物样品中确定NT

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于NT
‑
proBNP定量的高灵敏度颗粒增强测定


[0001]本公开涉及诊断测定领域，尤其涉及一种用于确定样品中N
‑
末端前激素BNP(NT
‑
proBNP)浓度的新型测定，包括用于执行此类测定的抗体、免疫颗粒、试剂和校准物。

技术介绍

[0002]脑利钠肽，又称为B型利钠肽，缩写为BNP，是心室中的心肌细胞响应于心室血容量增加、心壁应激引起的牵张而分泌的一种激素。NT
‑
proBNP是通过将proBNP切割成BNP和NT
‑
proBNP而产生的。参见图1。
[0003]测量BNP和NT
‑
proBNP可用于心力衰竭的诊断和监测。BNP和NT
‑
proBNP不可直接比较，因为BNP是生物活性代谢物，其半衰期(t
1/2
)约为20分钟，并且在肾脏中不会降解。它在体外只能稳定很短的时间。
[0004]然而，NT
‑
proBNP更稳定，它在生物学上没有活性，并且被肾脏过滤。其半衰期约为1至2小时，血液中的浓度高于BNP的浓度。与BNP相比，半衰期高度依赖于肾脏功能。在体外，NT
‑
proBNP比BNP更稳定，并且可在2
–
8℃的温度下储存至少三天。因此，proBNP和NT
‑
proBNP被用作心肌功能障碍(诸如心肌肥大和左心室心力衰竭)的金标准临床标志物。
[0005]对于BNP和NT
‑
proBNP，排除非急性症状患者心力衰竭的推荐截止值分别为35ng/L和125ng/L。对于呼吸困难或症状加重的患者，排除心力衰竭的推荐截止值更高，BNP和NT
‑
proBNP分别为100ng/L和300ng/L。然而，参考范围很宽，尤其是急性心力衰竭，尤其是老年患者，见表1：
[0006]表1.急性心力衰竭诊断的年龄分层截止值
[0007]年龄截止值灵敏度，％<50岁<450pg/mL9750
–
75岁<900pg/mL90>75岁<1800pg/mL85
[0008](Januzzi等人，“NT
‑
proBNP测试对急性不稳定型心力衰竭的诊断和短期预后：对1256例患者的国际汇总分析(NT
‑
proBNP testing for diagnosis and short
‑
term prognosis in acute destabilized heart failure:an international pooled analysis of 1256patients)”.《欧洲心脏杂志(Eur Heart J)》2006；27:330
‑
37)
[0009]NT
‑
proBNP是由76个氨基酸组成的肽链，其非糖基化形式的质量为8458Da。氨基酸序列在图2中显示。2006年之前，proBNP的糖基化未知。proBNP糖基化的第一个证据发表于2006年(Schellenberger,U.等人，“B型利钠肽的前体是一种O
‑
连接糖蛋白(The precursor to B
‑
type natriuretic peptide is an O
‑
linked glycoprotein)”，《生物化学与生物物理学集刊(Arch Biochem Biophys)》.2006年7月15日；451(2):160
‑
6.Epub 2006年4月19日)。糖基化的存在和对BNP较高分子量亚型的观察导致对血流中NT
‑
ProBNP相关形式的混淆。
[0010]2015年，研究表明，当样品用去糖基化酶预处理时，在Elecsys平台(罗氏诊断公司
(Roche Diagnostics))上使用proBNP II测定法测量更高的NT
‑
proBNP浓度(等人，“糖基化对急性呼吸困难中N
‑
末端前B型利钠肽的诊断和预后准确性的影响：来自Akershus心脏检查2研究的数据(Influence of glycosylation on diagnostic and prognostic accuracy of N
‑
terminal pro
‑
B
‑
type natriuretic peptide in acute dyspnea:data from the Akershus Cardiac Examination 2Study)”，《临床化学杂志(Clin Chem)》，2015年8月；61(8):1087
‑
97.doi:10.1373/clinchem.2015.239673.Epub 2015年6月8日)。
[0011]内源性proBNP和NT
‑
proBNP的确切糖基化位点仅最近才被表征(Halfinger,B.等人，“揭示患有严重心力衰竭的患者血浆中O
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糖基化内源性(N
‑
末端)前
‑
B型利钠肽形式的分子复杂性(Influence of glycosylation on diagnostic and prognostic accuracy of N
‑
terminal pro
‑
B
‑
type natriuretic peptide in acute dyspnea:data from the Akershus Cardiac Examination 2Study)”.《临床化学杂志(Clinical Chemistry)》.2017年，第63卷，第1期)。
[0012]用于检测NT
‑
proBNP的夹心免疫测定可商购获得，并且例如在EP 1151304(德国罗氏诊断股份有限公司(Roche Diagnostics GmbH))中公开，其涉及使用两种抗体的夹心测定法，这两种抗体识别天然NT
‑
proBNP的不同表位，同时可结合所述天然NT
‑
proBNP，其中至少两种抗体结合在N
‑
末端proBNP的氨基酸10
‑
50区域，并且抗体通过用重组NT
‑
proBNP免疫合适的生物体获得。
[0013]EP 1625163、EP 1625164和EP 2256132(德国罗氏诊断股份有限公司)定义对由38
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43、42
‑
46、39
‑
66、40
‑
47、41
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于确定样品中所述N
‑
末端前脑利钠肽(NT
‑
proBNP)浓度的方法，所述方法包含所述以下步骤：
‑
将所述样品与至少一种抗体接触，所述抗体与在SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列内的NT
‑
proBNP特异性结合；以及/或者
‑
将所述样品与至少一种抗体接触，所述抗体与在SEQ ID NO.3的所述氨基酸序列内的NT
‑
proBNP特异性结合；其中所述至少一种抗体固定在颗粒上；以及
‑
确定所述样品的反射率、散射率或透射率的变化，其中所述变化指示所述样品中所述NT
‑
proBNP浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗体与在SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列内的NT
‑
proBNP特异性结合。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述至少一种抗体包含多克隆抗体和/或单克隆抗体的混合物。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述多克隆抗体和/或所述单克隆抗体的混合物以小于10.0E
‑
09M，优选小于5.0E
‑
09M，更优选小于2.0E
‑
09M的对NT
‑
proBNP的K
D
特异性结合NT
‑
proBNP。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述多克隆抗体和/或所述单克隆抗体的混合物以小于5.0E
‑
09M，优选小于2.0E
‑
09M的K
D
特异性结合具有SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列的肽。6.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述多克隆抗体和/或所述单克隆抗体的混合物以小于10.0E
‑
09M，优选小于5.0E
‑
09M，更优选小于2.0E
‑
09M的K
D
特异性结合具有SEQ ID NO.3的所述氨基酸序列的肽。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述至少一种多克隆抗体或单克隆抗体的混合物特异性结合至少一种表位，所述表位选自由以下所述氨基酸组成的所述表位：SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO 5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9和/或SEQ.ID.NO.10。8.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用包含已知浓度物质的校准物进行校准的步骤，所述已知浓度物质选自具有SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列的肽或其片段；以及具有SEQ ID NO.3的所述氨基酸序列的肽或其片段；或其组合。9.一种免疫颗粒，其包含包覆有至少一种抗体的颗粒芯，所述抗体选自多克隆抗体或单克隆抗体的混合物，所述抗体与在SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列内的NT
‑
proBNP特异性结合；或者所述抗体与在SEQ ID NO.3的所述氨基酸序列内的NT
‑
proBNP特异性结合。10.根据权利要求9所述的免疫颗粒，其中所述至少一种抗体特异性结合具有SEQ ID NO.2的所述氨基酸序列的肽。11.根据权利要求9或10所述的免疫颗粒，其中所述多克隆抗体和/或所述单克隆抗体的混合物特异性结合NT
‑
proBNP，并且表现出小于10.0E
‑
09M，优选小于5.0E
‑
09M，更优选小于2.0E
‑
09M的对NT
‑
proBNP的K
D
。12.根据权利要求9
‑
11中任一项所述的免疫颗粒，其中所述至少一种多克隆抗体或单克隆抗体的混合物特异性结合至少一种表位，所述表位选自由以下所述氨基酸组成的所述
表位：SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO 5、SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9和/或SEQ.ID.NO.10。13.根据权利要求9
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12中任一项所述的免疫颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：英格维尔德，
申请(专利权)人：挪威金田有限公司，
类型：发明
国别省市：