通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法技术

本发明专利技术公开了一种通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，包括培育SD大鼠并获取睾丸、测定T水平、提取总RNA纯化合成cDNA并进行qPCR反应、获取总蛋白样品进行Western蛋白质条带密度分析、睾丸切片并染色、转录组测序分析、分析差异表达基因(DEGs)功能、计算并比较不同睾丸细胞类型的基因百分比等步骤，通过该方法可以对双酚A对睾丸间质细胞发育影响的机理进行研究判断，同时步骤简单高效。步骤简单高效。步骤简单高效。

【技术实现步骤摘要】
通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法


[0001]本专利技术涉及生物医药


技术介绍

[0002]1981年，双酚A，即2,2
‑
双(4
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羟基苯基)丙烷，缩写为BPA，首次作为聚碳酸酯塑料制造单体合成。从那时起，它已被广泛用于各种消费品，包括与食品密切接触的产品，如塑料婴儿奶瓶、食品罐内衬和牙科修复材料。除了来自一般环境，也就是水、空气和土壤的潜在暴露外，BPA也可能直接通过受污染的食品进入人体。调查表明，90％的美国普通人群的尿液样本中可检测到BPA，平均血清浓度为 2.5
‑
10.95ng/ml。同时最近的一项研究发现，中国3至11岁儿童尿液中的总双酚含量在0.43至31.5ng/ml之间。
[0003]目前有研究发现，双酚A被认为是一种内分泌干扰物，其作用类似于雌激素，并具有干扰雄激素合成的作用。双酚A对睾丸间质细胞发育的影响似乎取决于剂量和暴露时间。例如，子宫内暴露于高剂量 (40
‑
400mg/kg BW/day)的双酚A会抑制胎儿睾丸间质细胞和支持细胞的分化，并导致大鼠体内睾酮(T)的产生降低。然而，在新生小鼠第0
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9天使用剂量高达97mg/kg BW的BPA不会影响成年的生殖功能，而在小鼠青春期，即出生后第21
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35天，使用极低剂量(2.4 μg/kg BW/day)的BPA暴露会降低35天时的血清LH和T水平。此外，从妊娠第12天到出生后第21天的双酚A暴露，成年后睾丸间质液中的T水平降低，这意味着围产期是BPA暴露的敏感时期，成年大鼠直接暴露于双酚A两周也会降低睾丸重量和T水平，这意味着双酚A不仅会影响睾丸间质细胞的发育，还会影响其功能。尽管如此，大多数研究使用相对较高剂量的双酚A(1
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100毫克/千克体重/ 天)，但是不清楚双酚A作用的潜在机制，也没有很好的检测方法进行检测，并且睾丸间质细胞对于男性生殖系统的发育和男性生殖功能的维持至关重要。在大鼠中，成年睾丸间质细胞(ALC)由青春期的睾丸间质干细胞(SLC)发育而来，经过4个发育阶段：SLC、PLC(祖细胞LC)、ILC(未成熟LC)和ALC，成年鼠每个睾丸中总共形成了约2500万个ALC。出生后21
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35天，是PLC向ILC发展的时期，也是ALC发育中最关键的阶段之一，也是BPA暴露最敏感的阶段。然而，在这一阶段，BPA暴露的长期影响以及研究机理还不清楚，目前没有很好的判断研究方式。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，通过该方法可以对双酚 A对睾丸间质细胞发育影响的机理进行研究判断，同时步骤简单高效。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了一种通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，包括以下步骤，
[0006]步骤一，将SD大鼠置于23
±
2℃的恒温、55
±
5％的恒湿环境中，进行12小时的光/暗循环，并允许SD大鼠自由获取食物和水，将BPA 溶解在乙醇中，然后稀释在生育酚剥脱玉
米油中，直至乙醇的最终浓度为0.5％，用于胃内给药；将SD大鼠随机分为三组，分别设置为对照组、低剂量组和高剂量组，每组8只，从出生后第21天开始，每天分别灌胃0、0.1或10mg/kg BW剂量的BPA，持续14天；在出生第56天处死SD大鼠；收集干血，在4℃下以250g的转速离心15min，以收集血清，并在
‑
80℃下储存；将其中一个睾丸浸入液氮中冷冻，并在
‑
80℃下保存；将另一个睾丸固定在4％多聚甲醛中；
[0007]步骤二，使用2000试剂盒，通过免疫化学发光法测定血清T水平；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、双氢睾酮(DHT)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子1(IGF
‑
1)的浓度；T、LH、FSH、 DHT、GH和IGF
‑
1试剂盒的灵敏度分别为0.15ng/ml、0.2mIU/ml、 0.1mIU/ml、0.5pg/ml、0.1ng/ml和3ng/ml；
[0008]步骤三，通过定量PCR(qPCR)检测睾丸间质细胞类固醇合成基因和支持细胞标记基因的转录水平，使用微型试剂盒从睾丸中提取总RNA，使用NanoDrop ND
‑
1000测量RNA的数量和纯度，然后通过逆转录系统合成cDNA；在含有7.5ul480 Green I Master、0.75ul反向引物、0.75ul正向引物、10ul总量为1ng的RNA和4ul去酶水的容器中进行PCR反应；将核糖体蛋白 S16(RPS16)作为qPCR结果的标准内参物；
[0009]步骤四，用RIPA裂解缓冲液对睾丸组织进行均质和裂解获得总蛋白样品，使用增强型BCA蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，取 60μg总蛋白样品，在含有10％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上；用含5％BSA的TBST 封闭2h后，在4℃下将聚偏氟乙烯膜与一抗一起培育过夜；然后，将聚偏氟乙烯膜与山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP结合物或山羊抗兔IgG (H+L)在室温下培育2小时；通过Image J软件进行蛋白质条带密度分析，将β
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肌动蛋白作为内部对照值；
[0010]步骤五，选择CYP11A1作为识别睾丸间质细胞的生物标记物，先将睾丸固定，在乙醇和二甲苯中梯度脱水，将各SD大鼠睾丸切成 4部分后包埋于石蜡块中，然后在每个睾丸中随机取相同大小的部分作为组织阵列包埋在石蜡中，切割获得横截面厚度为5微米的切片，并将切片粘附在载玻片上；完成脱蜡和复水后，用含10％H2O2的甲醇孵育10min以阻断内源性过氧化物酶，用PBS冲洗切片；切片在 PH6.0的0.01M柠檬酸钠中加热，并在室温下冷却；用二抗宿主血清进行封闭后，切片在4℃下与CYP11A1兔克隆抗体孵育过夜，用PBS 洗涤，然后在室温下与Dylight 488山羊抗兔IgG(H+L)孵育1小时；在用PBS洗涤后，向切片中添加含有DAPI的抗荧光淬灭剂，以显示胞质为绿色的CYP11A1阳性细胞和蓝色细胞核；
[0011]步骤六，采用LC Bio Technology Co对对照组和低剂量组的睾丸 RNA样本进行RNA
‑
seq分析；通过生物分析仪2100对完整性RIN 值>7.0的RNA进行评估，并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行确认；将片段化的RNA通过逆转录酶的作用下合成cDNA；序列由Illumina
ꢀꢀ
NovaseqTM 6000平台完成匹配，采用R
‑
package
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edgeR软件包筛选差异倍数>1.5，P值本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过双酚A暴露重置脑垂体稳态增加成年大鼠血清睾酮的测试方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一，将SD大鼠置于23
±
2℃的恒温、55
±
5％的恒湿环境中，进行12小时的光/暗循环，并允许SD大鼠自由获取食物和水，将BPA溶解在乙醇中，然后稀释在生育酚剥脱玉米油中，直至乙醇的最终浓度为0.5％，用于胃内给药；将SD大鼠随机分为三组，分别设置为对照组、低剂量组和高剂量组，每组8只，从出生后第21天开始，每天分别灌胃0、0.1或10mg/kg BW剂量的BPA，持续14天；在出生第56天处死SD大鼠；收集干血，在4℃下以250g的转速离心15min，以收集血清，并在
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80℃下储存；将其中一个睾丸浸入液氮中冷冻，并在
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80℃下保存；将另一个睾丸固定在4％多聚甲醛中；步骤二，使用2000试剂盒，通过免疫化学发光法测定血清T水平；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定血清黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、双氢睾酮(DHT)、生长激素(GH)和胰岛素样生长因子1(IGF
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1)的浓度；T、LH、FSH、DHT、GH和IGF
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1试剂盒的灵敏度分别为0.15ng/ml、0.2mIU/ml、0.1mIU/ml、0.5pg/ml、0.1ng/ml和3ng/ml；步骤三，通过定量PCR(qPCR)检测睾丸间质细胞类固醇合成基因和支持细胞标记基因的转录水平，使用微型试剂盒从睾丸中提取总RNA，使用NanoDrop ND
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1000测量RNA的数量和纯度，然后通过逆转录系统合成cDNA；在含有7.5ul 480GreenI Master、0.75ul反向引物、0.75ul正向引物、10ul总量为1ng的RNA和4ul去酶水的容器中进行PCR反应；将核糖体蛋白S16(RPS16)作为qPCR结果的标准内参物；步骤四，用RIPA裂解缓冲液对睾丸组织进行均质和裂解获得总蛋白样品，使用增强型BCA蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度，取60μg总蛋白样品，在含有10％十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上；用含5％BSA的TBST封闭2h后，在4℃下将聚偏氟乙烯膜与一抗一起培育过夜；然后，将聚偏氟乙烯膜与山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP结合物或山羊抗兔IgG(H+L)在室温下培育2小时；通过Image J软件进行蛋白质条带密度分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈浩林，陈丹，管小菊，赵星仪，黄福，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：