新型配体测定制造技术

本发明专利技术涉及对与类固醇激素受体结合并且激活所述类固醇激素受体的配体的检测。具体地，本发明专利技术提供了用于从测试样品中选择性地鉴定类固醇激素受体配体的测试试剂盒和测定方法。重要的是，本文所述的测试试剂盒和测定方法是无细胞的，并且不需要制造费用高昂的核提取物来实现对所述测试试剂盒和测定方法的执行。相反，本文所述的测试试剂盒和测定方法采用如T7RNA聚合酶等与报告构建体连接的单多肽聚合酶。所述酶的活性被仅在目标配体存在的情况下才形成的配体结合的类固醇激素受体复合物抑制，而不是被激活。因此，可以使用所述报告构建体的物理性质(例如，荧光输出)的所测得的变化来确定所研究的样品中目标配体的存在。变化来确定所研究的样品中目标配体的存在。变化来确定所研究的样品中目标配体的存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型配体测定


[0001]本专利技术总体上涉及用于在样品中检测配体的测定、方法和测试试剂盒。具体地，本专利技术提供了用于针对配体的存在对测试样品进行筛选的测定、方法和测试试剂盒，所述配体的特征在于能够与类固醇激素受体形成复合物并且引发类固醇激素特异性基因组应答。

技术介绍

[0002]对能够引发类固醇激素基因组应答的配体的检测在生物化学、分子生物学和医学的许多领域中很重要。此类配体包含内源性类固醇、外源性类固醇、非类固醇分子和合成分子。例如，确定血清或血浆中的总激素生物活性对于监测人类健康相关病状很重要，所述人类健康相关病状包含衰老、围绝经期、更年期、雄激素缺乏症、雄激素过多症、激素替代疗法、包含乳腺癌和前列腺癌的内分泌癌、如骨质疏松症和肝毒性等其它激素相关病状、月经不调、多囊卵巢综合征、性发育障碍和不孕症。用于雄激素/雌激素和抗雄激素/抗雌激素分子的常规检测方法未提供关于激素生物活性的信息。激素生物活性是用于了解驱动健康病状的潜在机制以便可以实施适当的治疗/干预的重要度量。
[0003]检测样品中的激素生物活性对于监测非法的人和动物性能增强、伤害掩盖、补充剂和食品掺假、乳制品行业的生长促进剂以及环境污染剂也很重要。测量激素生物活性提供了关于可能调节身体内的内分泌途径，由此影响人类健康的污染物和/或掺杂物的信息。
[0004]引发类固醇激素基因组应答的配体首先通过在真核细胞的细胞质或核中与类固醇激素受体蛋白形成复合物来或激活类固醇激素受体蛋白以形成经激活的受体蛋白。配体取代受体蛋白上的辅因子，然后使DNA结合基序暴露。经激活的受体蛋白与第二经激活的受体蛋白二聚化，并且如果需要通过与被称为应答元件的特定核苷酸序列结合而与DNA相互作用，则移位到核。在正常的生物学功能中，与应答元件结合的经配体激活的类固醇激素受体蛋白的集聚通过增强或抑制对RNA聚合酶II介导的转录的启动来调节基因表达。RNA聚合酶II是通过使核苷酸三磷酸抵靠DNA模板聚合来组装以催化RNA转录的多亚基全酶。
[0005]类固醇激素基因组应答由与类固醇激素受体蛋白和受体特异性应答元件，例如雄激素受体(AR)和雄激素应答元件(ARE)、雌激素受体
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α(ER
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α)、雌激素受体
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β(ER
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β)和雌激素应答元件(ERE)、糖皮质激素受体(GR)和糖皮质激素应答元件(GRE)、盐皮质激素受体(MR)和盐皮质激素应答元件(MRE)、孕酮受体
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A(PR
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A)、孕酮受体
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B(PR
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B)和孕酮应答元件(PRE)结合的配体诱导。
[0006]然而，并非与类固醇激素受体蛋白结合的所有配体都会引发类固醇激素基因组应答。一些配体引发特征在于第二信使信号传导的非基因组应答，如G蛋白激活。此非基因组应答发生在配体结合的几秒到几分钟内，并且不是典型的类固醇激素应答。
[0007]用于检测样品中配体的存在的常用方法是直接在所述样品中测量配体。然而，样品通常是分子的复杂混合物，并且通常需要复杂的制备过程以进行分析。检测样品中配体的存在通常依赖于如液相或气相色谱等工艺将分子物种从复杂混合物中分离为相对纯的组分的级分，并且然后利用结构敏感型方法，如质谱对每种级分进行分析。可以使用此方法
对任何一个样品中的多于100个配体进行测试。自动纯化系统、气相或液相色谱和质谱仪是必须由经过培训的技术人员不断校准和操作以产生可靠的结果的昂贵且技术复杂的实验室仪器。另一个缺点是可以通过与如性激素结合球蛋白或血清白蛋白等蛋白质相互作用而使一些配体为生物上非活性的，并且此方法不在配体的生物上活性的级分与生物上非活性的级分之间进行区分。此外，电离的过程可能导致某些类固醇分子崩解，从而无法使用此类方法对其进行测量。另外，此方法在以下情况下不提供关于样品的由多个配体产生的总生物活性的信息：无法鉴定所有已知配体；或者可以鉴定配体，不知道活性是加性的、协同的，还是甚至是竞争性的。此外，由于配体的生物代谢，需要预先了解配体和其相关代谢物的分子结构，以实现对样品中配体的存在的可靠鉴定。
[0008]用于检测样品中类固醇激素配体的存在的另一个常用方法是使用基于免疫学技术的生物测定，如放射免疫测定和酶联免疫吸附测定。免疫学技术的局限性是需要抗体分子直接检测配体或检测与性激素结合球蛋白直接结合的配体。免疫学测定由于测定的通过不同制造产生的抗体分子的高度可变性而缺乏再现性。
[0009]为了克服对在样品中检测配体的局限性，已经开发了基于细胞的类固醇激素测定，其中配体与类固醇激素受体蛋白结合并且引发类固醇激素基因组应答。在这些测定中，样品中配体的存在是在类固醇激素受体被激活并且增加然后转化成蛋白质的报告基因的RNA聚合酶II转录之后进行检测的。最常见地，报告基因对荧光蛋白(如GFP)或酶进行编码，所述GFP或酶将在特定底物存在的情况下诱导光或比色反应。
[0010]然而，存在与这些基于细胞的测定相关联的局限性，因为所述测定需要专门的装备和专业知识来维持活细胞培养。这增加了基于细胞的测试的成本并且减少了这些方法的高通量应用。另外，活细胞的高度分子复杂性使测试变得困难，并且降低了特异性和再现性两者。
[0011]为了克服对使用基于细胞的测定在样品中检测配体的局限性，开发了在样品中检测配体的无细胞系统，其中所述配体能够引发类固醇激素基因组应答。
[0012]然而，无细胞测定的局限性在于需要使用多亚基全酶聚合酶，如RNA聚合酶II。重组产生RNA聚合酶II极度难以以可变的再现性实现，并且因此，通常通过使用所有组分都存在并在启动子序列处聚集在一起的核提取物来使全酶可用。然而，由真核细胞制备核提取物在制造上费用高昂，因为需要费用高昂的细胞生长培养基和富集核材料所需的技术专业知识。
[0013]具体地，本专利技术提供了涉及单多肽聚合酶的测试试剂盒、测定和方法，所述聚合酶的活性通过与类固醇激素受体蛋白结合的配体而降低或受到所述配体的抑制而不是被所述配体激活。

技术实现思路

[0014]本文描述和要求保护的专利技术具有许多属性和实例，包含但不限于在本
技术实现思路
中阐述或描述或引用的那些。其不旨在是包罗万象的，并且本文描述和要求保护的专利技术不限于本
技术实现思路
中鉴定的特征或实例，包含这些特征或实例仅出于说明而非限制的目的。
[0015]在本专利技术的一方面，提供了一种用于针对能够引发类固醇激素基因组应答的配体的存在对样品进行筛选的测试试剂盒，所述测试试剂盒包括：
[0016](i)类固醇激素受体，所述类固醇激素受体能够与来自所述样品的配体形成受体
‑
配体复合物；以及
[0017](ii)核酸分子，所述核酸分子包括：
[0018](a)聚合酶启动子序列；
[0019](b)应答元件，所述应答元件能够被所述受体
‑
配体复合物结合；以及
[0020](c)报告构建体，
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:8)的序列，其中n为A、T、G或C；c.孕酮应答元件(PRE)，所述PRE包含但不限于包括5'
‑
GGTACAAACTGTTCT
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3'(SEQ ID NO:10)的序列；d.盐皮质激素应答元件(MRE)，所述MRE包含但不限于包括5'
‑
AGAACAnAATGTTCT
‑
3'(SEQ ID NO:12)的序列，其中n为A、T、G或C；以及e.糖皮质激素应答元件(GRE)，所述GRE包含但不限于包括5'
‑
AGAACAnAATGTTCT
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3'(SEQ ID NO:12)的序列，其中n为A、T、G或C。12.根据权利要求1到11中任一项所述的测试试剂盒，其中所述测试试剂盒被配置成检测与雄激素受体结合的配体，并且所述核酸分子包括由SEQ ID NO:14定义的序列，或其中所述测试试剂盒被配置成检测与雌激素受体结合的配体，并且所述核酸分子包括由SEQ ID NO:15定义的序列。13.一种用于在样品中检测配体的测定方法，所述配体能够引发类固醇激素基因组应答，所述测定方法包括以下步骤：(i)使样品与以下接...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：因斯图根有限公司，
类型：发明
国别省市：