可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液，其中所述试剂检测卡包括反应部和含有滤血膜和滤芯的滤血部，冻干小球为10～15μL包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被亲和素的供体浓缩微球试剂冻干形成的小球；本发明专利技术的试剂卡在孔抽负压下将样品经滤红细胞装置送至检测孔，与三种冻干小球复溶，一步法孵育，检测光信号，可对抗原或抗体进行定量检测，具有高精度、高稳定性以及好的滤红细胞效果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于免疫检测试剂盒
，具体涉及一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术背景
[0002]光激发均相发光是将抗原、抗体或者基因探针分别与受体微球和供体微球连接，当发生特异性的分子结合时，两种微球连接在一起，此时如果有特定的光源照射反应体系，则包含在其中的一个供体微球中的光敏剂会将环境氧转化为激发态的单线态氧，单线态氧可以氧化另一个受体微球的发光剂而发光；若是两种微球没有结合，由于距离较远，寿命较短的单线态氧无法到达另一个受体微球并使其发光。因此，光激发均相发光技术显示出巨大的优势，其操作简单，测试速度快，精密度好，并且减少管路清洗系统，很大程度减少仪器的体积大小及维护、耗材费用。
[0003]目前，标记免疫分析技术仍以固相方式为主，即免疫复合物在固相载体上形成，并通过洗涤去除未结合的反应物和反应基质，而光激发均相发光技术的特点是无需分离免疫复合物，虽然固相免疫具有检测灵敏度高、线性范围宽的优点，但不足之处是反应时间长，操作步骤多，检测结果精密度不及均相反应。中国专利CN101750487B公开了一种干法光激化学发光免疫检测试剂盒，其微粒发光溶液中需要添加海藻糖，用于干燥过程中起支撑定型效果，防止试剂分子之间脱水，但因此增加成本，工艺复杂化，另一方面，该试剂盒在使用过程中需要经两步温育后进行光子信号检测，增加了人工加样过程中的误差。中国专利CN113092767A公开了一种鲎试剂冻干微球及其制备方法和应用，该微球的冻干过程需要控制温度进行预冻，增加了操作难度。目前，市面常规的光激发均相发光试剂均以液相产品为主，液态试剂的运输和储存稳定性受到很大限制，供体和受体微球采取逐步加液体试剂的形式会影响检测的精密度，若出产产品需人工完成试剂加样，则造成偏差更大。因此，如何提高光激发均相发光试剂的运输、储存稳定性，简化试剂的制备工艺，同时在操作过程中减小人为因素的影响，提高检测的精密度，对光激发均相发光技术的应用提供广阔的前景。

技术实现思路

[0004]针对上述现有的技术问题，本专利技术提供了一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法；
[0005]本专利技术的原理：在680nm左右激发光激发下，包被有亲和素的填充有酞菁衍生物的供体微球可以产生单线态氧，当供体微球连接生物素标记抗体或抗原，并且进一步连接检测对象及包被有抗体或抗原的受体微球时，单线态氧可传递至受体微球上，并与填充在受体微球上的二甲基噻吩发生化学反应，产生紫外光，紫外光进一步激发填充于受体微球上的铕螯合物产生光子；若是受体和供体微球未通过检测对象结合，则单线态氧由于传输距离太远而无法到达受体微球使其发光。
[0006]本专利技术所述试剂检测卡包括反应部和滤血部；
[0007]所述滤血部下端和反应部中间部位通过通道连接；
[0008]所述的滤血部有复合滤血装置，所述复合滤血装置包括滤血膜、滤芯；
[0009]所述的滤血装置包含滤血膜和滤芯，其中滤芯为下方孔径2
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10μm左右，直径4.5
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4.7mm，厚度2
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3mm的聚乙烯烧结滤芯，在滤芯上方加装1
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2μm孔径的滤血膜，所述滤血装置中滤芯和滤血膜位置可以互换，该装置可直接添加含有红细胞的样品上样检测，对样品中絮状等粒径较大且不参与反应的杂质和血细胞进行过滤。
[0010]所述可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒由试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液组成；
[0011]所述进样稀释液采用生理盐水添加防腐剂的形式；
[0012]所述可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法如下：
[0013]1)制备标记物试剂：分别将包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被有亲和素的供体微球与缓冲液混合得到；
[0014]2)冻干：采用滴珠机步骤1)中的三种标记物试剂经滴珠机呈小液滴滴落，滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状，将液氮冷冻小球直接转至液氮预冷过的铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，再进一步转移至冻干机进行冷冻干燥；
[0015]3)分拣：将三种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡中，分装结束对试剂卡进行封口，并将试剂卡放入装有干燥剂的密封袋密封。
[0016]所述步骤1)中的标记物分别为生物素标记抗体/抗原、包被有抗体/抗原的受体微球、包被有亲和素的供体微球，三种标记物的标记过程如下：
[0017]1)生物素标记抗体/抗原：取一定体积的0.05M pH9.5 CB缓冲液，以此投入一定摩尔比的生物氨基己酰基
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氨基己酸N
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羟基琥珀酰亚胺酯和抗体/抗原，25℃反应2h后加入1％甘氨酸封闭30min，在0.01M pH7.4的PBS缓冲液透析至无残留生物素取出采用Thermo蛋白检测仪检测蛋白浓度；
[0018]2)包被有抗体/抗原的受体微球：取适量的200nm左右的羧基受体微球用0.05M pH5的MES清洗离心两遍后，按照一定的比例和顺序加入适量的抗体/抗原，m＝1/50m微球的EDC，加入10％Tween20至终浓度0.1％，30℃反应2h。偶联结束后，加入10％牛血清白蛋白浓度至终浓度0.1％，加入0.6％乙醇胺，30℃封闭30min，封闭结束后根据缓冲液稀释至20
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50mg/mL；
[0019]3)包被有亲和素的供体微球：取适量的200nm左右的羧基供体微球用0.05M pH5的MES清洗离心两遍后，按照一定的比例和顺序加入适量的亲和素，m＝1/50m微球的EDC，30℃反应2h，偶联结束后，加入0.1％牛血清白蛋白，加入0.6％乙醇胺，30℃封闭30min，封闭结束后根据缓冲液稀释至20
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50mg/mL。
[0020]所述步骤1)中的缓冲液为含有氯化钠、Tween20、牛血清白蛋白、Proclin
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300和去离子水的PB、MES或TRIS体系中的一种或组合；
[0021]由于本专利技术的试剂盒在制备过程中，NaCl浓度通过影响冻干共晶点，影响升华干燥的温度和时间，进一步影响冻干小球的成型形态，最终对光激发化学发光检测结果产生影响，因此，本专利技术对NaCl含量进行优化；
[0022]所述步骤1)中缓冲液的NaCl添加量为0～0.9％；
[0023]所述步骤1)中的缓冲液还可添加保护剂为葡聚糖20000、抗坏血酸、酪蛋白、赖氨
酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、Tween80、Tween20、Triton X
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405、Triton X
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100、酪蛋白钠盐、甘氨酸、PEG20000、PRG8000、PEG6000、PEG2000、PEG200、PVP29000、PVP40、PVP10中的一种或多种。
[0024]所述步骤2)中液氮冷冻小球放置于铝制盘、不锈钢盘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种试剂检测卡，其特征在于，所述试剂检测卡包括反应部和滤血部；所述滤血部下端和反应部的中间部位通过通道连接；所述滤血部有复合滤血装置，所述复合滤血装置包括滤血膜、滤芯。2.根据权利要求1所述的试剂检测卡，其特征在于，所述滤血膜孔径为1
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2μm，滤芯为孔径2
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10μm，直径4.5
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4.7mm，厚度2
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3mm的聚乙烯烧结滤芯；所述复合滤血装置中滤芯和滤血膜的位置可以互换。3.一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由权利要求1所述的试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液组成，所述进样稀释液由生理盐水和防腐剂组成。4.根据权利要求3所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备标记物试剂：分别将包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被有亲和素的供体微球与缓冲液混合制备工作浓度；2)冻干：采用滴珠机将步骤1)中的三种标记物试剂经滴珠机呈小液滴滴落，滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状，将液氮冷冻小球直接转至含有液氮的铝制盘中并进一步转移至冻干机进行冷冻干燥；3)分拣：将三种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡中，分装结束对试剂检测卡进行封口，并将试剂检测卡放入装有干燥剂的密封袋密封。5.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的缓冲液为含有氯化钠、Tween20、牛血清白蛋白、色素、Proclin
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈东慧，张国锋，张伟，杨苏清，敖艳艳，
申请(专利权)人：深圳宝恒投资有限公司上海宝太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：