控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点检测引物和检测方法及应用技术

控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点检测引物和检测方法及应用。本发明专利技术首先公开了一个控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点，所述突变位点位于植物CPS基因的第2768位核苷酸，从鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致CPS蛋白Terpene synth结构域中的第326位缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)。所述突变位点直接影响植物的赤霉素合成量及株型，所述位点突变会导致植物体内赤霉素含量低，株型矮化、丛生。本发明专利技术还公开了用于检测该突变位点的引物以及检测方法，所述突变位点和引物在植物赤霉素合成量调节及株型改造的辅助选择育种，以及通过基因编辑该位点达到植物赤霉素合成量调节及株型改造的应用。型改造的应用。型改造的应用。

【技术实现步骤摘要】
控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点检测引物和检测方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一个控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点、检测突变位点的引物对及检测方法和应用。

技术介绍

[0002]赤霉素(Gibberellins,GA)是植物经典激素之一，主要控制种子萌发，茎干伸长，叶片、花和种子发育等重要过程，对植物生长和发育起着关键调控作用。
[0003]在被子植物中，编码柯巴基焦磷酸合酶(copalyl diphosphate synthase,CPS)是双萜合酶基因，参与完成赤霉素合成通路的第一阶段。拟南芥中CPS基因只有一个拷贝，该基因也被称为GA1基因，突变后会导致种子萌发困难，植株极度矮小，叶片小而深绿，花瓣、萼片和雌蕊严重发育不全、雄性败育，外施赤霉素可以恢复突变体表型。水稻中有四个CPS基因(OsCPS1
‑
OsCPS4)，OsCPS1主要参与赤霉素的合成。
[0004]在上个世纪60年代开始的第一次绿色革命，就是利用水稻中的赤霉素合成基因sd1和小麦中的信号转导基因Rht的优异等位基因培育出抗倒伏、高产新品种，极大推动了粮食产量的提升。这些研究表明赤霉素对于农作物的株型，育性以及收获指数影响很大。这表示赤霉素在株型创建等辅助育种中的潜力巨大，有待进一步挖掘。因此，利用赤霉素合成酶基因关键位点的突变，使赤霉素合成酶酶活改变，进而改变植物中赤霉素合成量和株型的改变，是发掘和培育赤霉素合成量适度，株型优异的农作物新种质，新品种的一种重要途径。同时还可以通过特定引物序列对这些关键位点所在片段进行扩增，并测序确定这些位点的基因型，进而实现分子辅助设计育种。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是针对赤霉素合成基因在调节植物体内赤霉素合成量，产生合适株型在种质创新和育种上应用潜力挖掘的不足，提供一个可以调节植物赤霉素合成量并进一步影响株型的突变位点及其产生的理想株型在农作物新品种培育方面的应用。
[0006]本专利技术的另一目的为提供检测该突变位点的引物。
[0007]本专利技术的又一目的为提供该突变位点的检测方法。
[0008]本专利技术的技术方案：
[0009]一个控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点，所述突变位点位于植物CPS基因的第2768位核苷酸从鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致CPS蛋白第326位的缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)，进化中保守的V326位于Terpene synth(272
‑
478)结构域中。所述突变位点是一个影响CPS酶活的关键位点，与植物的赤霉素合成量及株型直接相关，该位点的突变会显著降低植物体内赤霉素的合成量，导致植物根短、矮化、丛生。
[0010]一种用于检测上述突变位点的特异性引物对，正向引物为LP:ACwGCwTdyGCdyTbATGCA，反向引物为RP:CGnGGyArGCTnGCrTACCT。
[0011]一种检测植物基因组中是否存在本专利技术所述的基因突变位点的方法，包括：以待测植物的基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物对进行PCR扩增，利用所述正向引物LP对扩增产物测序分型；扩增产物的序列峰图中编码保守位点V326的密码子GTG的第一个碱基为单峰A的，为AA基因型，表明该植株存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量低，株型矮；编码保守位点V326的密码子GTG的第一个碱基为单峰G的，为GG基因型，表明该植株不存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量高，株型高。
[0012]本专利技术所述的引物和检测方法对在植物编码CPS基因保守位点V326密码子中的第一碱基进行分析，用于检测V326位点是否突变或发生定点编辑，进而调节赤霉素合成量及株型创建的辅助选择育种中的应用。
[0013]本专利技术的优点和有益效果：
[0014]本专利技术提供了可以控制植物赤霉素合成并进一步影响株型的突变位点检测引物及其检测方法，可用于该位点定点编辑创造更适赤霉素合成量和理想株型农作物种质，该种质可进一步应用于基因辅助选择育种。
附图说明
[0015]图1Col
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0和突变体ga1
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168中赤霉素含量(ng/g FW)。
[0016]图2Col
‑
0和突变体ga1
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168的株型。
[0017]图3Col
‑
0和突变体ga1
‑
168测序比对结果。
具体实施方式
[0018]实施例1：
[0019]本专利技术所述的检测所述突变位点的方法，包括以下步骤：
[0020]1、DNA提取
[0021]以植物(主要包括农作物玉米，水稻，大麦，大豆，番茄，油菜)的叶片为材料提取基因组DNA，采用CTAB法提取。
[0022]2、引物设计
[0023]根据玉米，水稻，大麦，大豆，番茄，油菜的CPS基因序列，利用Primer5.0软件设计1对引物，正向引物为LP:ACwGCwTdyGCdyTbATGCA(SEQ ID NO.1)，反向引物为RP:CGnGGyArGCTnGCrTACCT(SEQ ID NO.2)。引物可委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0024]3、PCR扩增
[0025]在0.2mL的PCR扩增专用薄壁管中，PCR扩增体系为35μL，主要包括：2μL植物基因组DNA，0.25μM正向引物，0.25μM反向引物，17.5μL 2
×
Rapid Taq Master Mix(南京诺唯赞公司)，用双蒸水定容至35μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性20s，58℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸5min。本专利技术采用的热循环仪为BioRad公司的C1000型。
[0026]4、电泳图谱分析
[0027]扩增产物使用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。在凝胶成像仪(Tanon公司)上观察凝胶上的电泳条带，通过比对DNAmarker判断电泳条带的大小，其中玉米电泳条带大小应为
984bp(SEQ ID NO.3)，水稻为1085bp(SEQ ID NO.4)，大麦为1181bp(SEQ ID NO.5)，大豆为1519bp(SEQ ID NO.6)，番茄为1086bp(SEQ ID NO.7)，油菜为1048bp(SEQ ID NO.8)。PCR扩增产物采用纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)纯化后，直接由生工生物工程(上海)股份有限公司利用正向引物LP进行测序。
[0028]5、测序分型
[0029]测序峰图用snapgene软件进行分析。根据峰图判断基因型，其中序列峰图中编码保守位点V326的密码子GTG的第一个碱基为单峰G的为GG型，表明该植株不存在所述的基因突变位点，该植物样品赤霉素合成量高，株型高。如果编码保守位点V326的密码子GTG的第一个碱基为单峰A的为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测植物基因组中是否存在控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点的引物对，其特征在于正向引物为LP:ACwGCwTdyGCdyTbATGCA，反向引物为RP:CGnGGyArGCTnGCrTACCT。2.根据权利要求1所述的用于检测植物基因组中是否存在控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点的引物对，其特征在于所述突变位点位于植物CPS基因的第2768位核苷酸，从鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，导致CPS蛋白Terpene synth结构域中的第326位缬氨酸(V)突变成蛋氨酸(M)；所述突变位点与植物的赤霉素合成量及株型显著相关，所述位点突变会导致植物体内赤霉素含量低，株型矮化、丛生。3.权利要求2所述引物对在检测控制植物赤霉素合成和株型的基因突变位点中的应用；所述突变位点直接影响植物的赤霉素合成量及株型，该位点具有AA基因型的植株体内赤霉素含量及株高显著低于具有GG基...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌宏清，刘毅，
申请(专利权)人：江西省中国科学院庐山植物园，
类型：发明
国别省市：