一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法和复合菌剂技术

本发明专利技术提供一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法，是在富含锰离子的培养基中同时发酵培养枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌。所述的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌NT66株，于2021年11月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23751。本发明专利技术将经过高锰离子驯化的枯草芽孢杆菌菌株与丁酸梭菌按一定比例联合培养，即可提高枯草芽孢杆菌的数量，而且有效的提高驯化后的枯草芽孢杆菌菌株中的小肽含量，制备的菌产品能有效的增强动物免疫力，促进了生长发育，提高饲料利用率。提高饲料利用率。提高饲料利用率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法和复合菌剂


[0001]本专利技术属于畜禽微生态制备
，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子(Mn
2+
)含量的方法和复合菌剂。

技术介绍

[0002]在畜禽养殖领域中，饲料中添加适宜锰离子(Mn
2+
)能促进畜禽生长发育，增强蛋禽蛋蛋壳质量。据报道，锰消化吸收利用率很低，家禽仅有2～5％。饲料中直接添加的无机锰Mn
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大部分被排出到机体外；尤其是规模化畜禽养殖中，排放到环境中锰离子的含量很高，日积月累后很容易造成水体富营养化，并导致畜禽产品Mn
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含量高；由于畜禽粪污含有金属Mn
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高，生产的农产品Mn
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的残留量也高，从而危及食品安全和整个生态环境。因此，探究一种既满足促进畜禽生长发育、维护肠道健康和提高家禽蛋壳强度，又能够减少锰排放量的方法，对畜牧业营养精准化和维护生态良好循环具有重大社会价值。
[0003]然而，没有驯化的枯草芽孢杆菌对金属富集具有一定的惰性，尤其是对Mn
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富集是十分有限的。通过一定方法进行强化驯化培养的枯草芽孢杆菌能够大大增强富集Mn
2+
的耐受能力，对高浓度Mn
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离子的富集具有很好的适应性和承载能力。驯化菌的特异性为生产富锰枯草芽孢杆菌饲料添加剂奠定了良好基础。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法，从而有效的提高枯草芽孢杆菌中的锰离子的含量，弥补现有技术的不足。
[0005]本专利技术所提供的提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法，是在富含锰离子的培养基中同时发酵培养枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌；
[0006]所述的培养基中锰离子的浓度为15～70.0mg/L；优选为40.0mg/L。
[0007]作为实施例的具体记载，所述的培养基的一种具体组成如下：蛋白胨5～15g/L，牛肉浸粉1～5g/L，NaCl 1～10g/L，Mn
2+
浓度15～70.0mg/L，pH值5.5～7.9
±
0.2。
[0008]更进一步的，所述的枯草芽孢杆菌在含有高浓度Mn
2+
离子的培养基中经过了驯化。
[0009]所述的枯草芽孢杆菌菌株，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)耐锰枯草芽孢杆菌NT66株，于2021年11月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23751。
[0010]本专利技术还提供一种复合菌剂，包含有驯化的枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌；
[0011]作为优选，所述的复合菌剂中枯草芽孢杆菌NT66株与丁酸梭菌的数量比为1︰1～2。
[0012]本专利技术将经过高锰离子驯化的枯草芽孢杆菌菌株与丁酸梭菌联合培养，即可以提高枯草芽孢杆菌的数量，而且有效的提高驯化后的枯草芽孢杆菌菌株中的小肽含量。枯草芽孢杆菌NT66株与丁酸梭菌组合的菌剂具有良好的使用效果，能有效地增强动物免疫力，
抑制有害菌，维护肠道健康，促进生长发育，提高饲料利用率。
附图说明
[0013]图1：驯化对枯草芽孢杆菌形态的影响图；
[0014]图2：枯草芽孢杆菌锰在含有丁酸梭菌上清液的液体培养基中发酵图，其中对照组为枯草芽孢杆菌锰在普通液体培养基发酵，实验组为枯草芽孢杆菌锰在含有丁酸梭菌上清液的液体培养基中发酵。
[0015]图3：丁酸梭菌在含有枯草芽孢杆菌锰上清液的液体培养基中发酵图，其中对照组为丁酸梭菌在普通液体培养基中发酵；实验组为丁酸梭菌在含有枯草芽孢杆菌锰上清液的液体培养基中发酵。
[0016]图4：蛋白标准曲线图；
[0017]图5：不同浓度的丁酸标准品通过液相色谱法测定图；
[0018]图6：丁酸标准曲线图。
具体实施方式
[0019]枯草芽孢杆菌不是肠道的常住菌，只属于过路菌，不会在肠道内长期定植与生长，它会随着食物进入胃肠道，最终又与粪便一起排出体外，并在养殖环境中发挥作用。枯草芽孢杆菌属于耗氧菌，耐胃酸胆盐强，能够保持较高活力，抑制肠道有害菌繁殖。本专利技术将枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌联合培养，可以使枯草芽孢杆菌菌体中富集更多的有机锰。
[0020]下面结合具体实施案例对本专利技术进行详细描述。
[0021]实施例1：培养驯化枯草芽孢杆菌
[0022]采用逐步提高培养基中Mn
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浓度、提高培养温度的方式进行驯化；将驯化后的菌种再连续培养若干代后，与驯化前的枯草芽孢杆菌进行菌体形态、酶活、小肽、氨基酸等比较，进一步确定驯化后的枯草芽孢杆菌性质特点，并且能够稳定传代。驯化对枯草芽孢杆菌形态的影响见图1。从图1中可以看出，菌种在同等倍数下，富锰的枯草芽孢杆菌菌体变得粗长，表面纹理清晰、光滑。说明在锰离子的驯化作用下，对枯草芽孢杆菌的外表形态有明显改变。
[0023]其中驯化培养的一株能够耐受高浓度硫酸锰(300mg/L)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NT66株，于2021年11月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 23751。
[0024]分别采用驯化的富铜枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.15329)、富锌枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.15330)与本专利技术的富锰枯草芽孢杆菌(保藏号：CGMCC No.23751)进行富集锰离子发酵。在含40mg/L锰离子浓度的培养基中分别接种耐铜、耐锌和耐锰的枯草芽孢杆菌种，在37℃下培养24h后，将菌液离心洗脱烘干，进行菌体含量以及菌体有机锰含量测定。
[0025]结果表明，驯化的富锰枯草芽孢杆菌，当锰添加量为40.0mg/L时，菌体含量为0.46g/L，菌体的有机锰含量为2521.26mg/kg，远远大于富铜枯草芽孢杆菌和富锌枯草芽孢杆菌的锰含量，证明驯化的菌种具有较好的富锰效果。而以前驯化的富铜枯草芽孢杆菌或
富锌枯草芽孢杆菌并不能达到本专利技术菌株的富锰效果。
[0026]而且，由于在富锰驯化中也进行了高温耐受性驯化，所以筛选驯化的富铜枯草芽孢杆菌相比于未驯化的常规枯草芽孢杆菌具有更高的温度耐受性。30～40℃为枯草芽孢杆菌的适宜生长温度，在该温度条件下，枯草芽孢杆菌每隔20～30分钟繁殖一代。而温度超过50℃，富锰枯草芽孢杆菌的生长速度受到抑制，但可以形成芽孢抵抗高温环境。而本专利技术驯化后的富锰枯草芽孢杆菌在60℃以上的高温还可以存活，且存活率大大高于未驯化的普通枯草芽孢杆菌菌种。超过60℃酵母菌不能存活，超过70℃双歧杆菌不能存活，本专利技术筛选驯化的富锰枯草芽孢杆菌在100℃的温度下还可以存活10分钟左右。表明，驯化的富锰枯草芽孢杆菌具有明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高枯草芽孢杆菌中锰离子含量的方法，其特征在于，所述的方法是在富含锰离子的培养基中同时发酵培养枯草芽孢杆菌和丁酸梭菌。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基中锰离子的浓度为15～70.0mg/L。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的培养基中锰离子的浓度为40.0mg/L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基的组成如下：蛋白胨5～15g/L，牛肉浸粉1～5g/L，NaCl 1～10g/L，Mn
2+
浓度15～70.0mg/L，pH值5.5～7.9
±
0.2。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝维，杨铸钰，邹函峪，王秉翰，张名爱，凡文磊，孔敏，
申请(专利权)人：青岛慧和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：