一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法技术

本发明专利技术涉及一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，通过在淡紫链霉菌海南变种发酵培养基依次添加一定量沼泽红假单胞菌超滤液和松树叶、刺五加和虎杖蒸煮液，该方法有效地提高了淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的生物效价，也进一步提高中生菌素原料药生产企业效率。产企业效率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法


[0001]本专利技术属于农药领域，具体涉及一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法。

技术介绍

[0002]中生菌素（zhongshengmycin）又名农抗751菌素、链丝菌素，属N
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糖苷类抗生素。中生菌素有效成分为链丝菌素（streptothricins）F，是由Waksman等于1942年从Streptomyces lavendulae中分离到的；随后，链丝菌素的其它组分(链丝菌素 A、B、C、D、E和X)也相继被发现，其各组分的结构中均包含一分子古洛糖胺、一分子链里定内酰胺和数量不等的 β
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赖氨酸。中国农业科学院生物防治研究所首次从海南土壤中分离得到并命名淡紫链霉菌海南变种。中生菌素抗菌谱广，能抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、酵母菌及丝状真菌等，对昆虫也有一定的杀灭作用。其杀菌机理是能够抑制polyU引导的多肽合成，并能导致蛋白翻译中的错读，使细菌不能合成蛋白质而死亡。中生菌素在农业上防治细菌性病害有广普性，如对猕猴桃的溃疡病、黄瓜细菌性角斑病和霜霉病、番茄细菌性斑疹病和叶霉病、西瓜细菌性角斑病、苹果斑点落叶病和褐斑病、梨黑星病、葡萄霜霉病、白粉病和黑痘病、柑橘溃疡病等。由于具有显著且直接杀菌作用，因此产生中生菌素的链霉菌在自然界比较容易被发现并分离得到，如秦岭链霉菌（Streptomyces qinlingnensis sp. nov）等多个链霉菌均能产生中生菌素。在国内，中生菌素原料药生产是通过淡紫链霉菌海南变种发酵获得的，如何提高中生菌素发酵过程中的生产效价，是生产企业亟需解决关键技术问题。

技术实现思路

[0003]为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，通过在淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的发酵培养基依次添加沼泽红假单胞菌滤膜处理液、松树叶、刺五加和虎杖蒸煮液，有效底提高了淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的效价，也进一步提高了中生菌素原料的含量。
[0004]为了实现专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，包括以下步骤：（1）配制沼泽红假单胞菌培养液培养沼泽红假单胞菌更为具体的，沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；K2HPO4，0.05g；KH2PO4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；MgSO4·
7H2O，0.02g；NaCl，0.1g；CaCl2，0.008g；，NaAc 4g；生长因子，1
‑
2mL；微量元素，1
‑
2mL；蒸馏水，96
‑
98mL；pH调节为7.0；更为具体的，生长因子组成如下：维生素B1，0.0005
‑
0.002mg；尼克酸0.05
‑
0.25mg；对氨基苯甲酸，0.05
‑
0.3mg；生物素，0.0005
‑
0.002mg；蒸馏水1000mL；过滤除菌；更为具体的，微量元素组成如下：
FeCl3·
6H2O 4
‑
10mg；CuSO4·
6H2O 0.01
‑
0.09mg；H3BO4，0.5
‑
1.5mg；MnCl2·
4H2O，0.01
‑
0.09mg；ZnSO4·
7H2O，0.5
‑
1.5mg；Co(NO3)
·
6H2O，0.1
‑
0.9mg；蒸馏水1000mL；过滤除菌；更为具体的，配置方法为：按配比称取所需原料，然后加入适量蒸馏水，在加热条件下搅拌溶解，待其全部溶解后取出，放在室温环境下冷却后，加入生长因子和微量元素各1
‑
2mL调节溶液的pH至7.0，再灭菌后，放入4℃的环境下保存备用；（2）培养沼泽红假单胞菌，培养条件为：用低温保存的培养基接种沼泽红假单胞菌，在室温下培养，采用4500
‑
5000Lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境24小时，培养5
‑
7d，沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05
‑
1.50
×
10
9 cell/mL；（3）当培养的沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05
‑
1.50
×
10
9 cell/mL时，收集沼泽红假单胞菌，超声破碎沼泽红假单胞菌，超声频率为20
‑
40KHz，功率为1
‑
4.0Kw，超声时间为30
‑
60min，然后0.22μm微孔滤膜过滤，得到沼泽红假单胞菌滤膜处理液；（4）配置淡紫链霉菌海南变种发酵培养基更为具体的，淡紫链霉菌海南变种发酵培养基的配方为：可溶性淀粉（AR）1.0%、MgSO4·
7H2O（AR）0.045%、KH2PO4（AR）0.10%、KCl（AR）0.045%、NaNO3（AR）0.125%、FeSO4·
7H2O（AR）0.001%，其余是蒸馏水，pH6.8
‑
7.0，经高温消毒配置；（5）上述步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液添加步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
[0005]在本专利技术的优选的实施方式中，步骤（1）中，沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；K2HPO4，0.05g；KH2PO4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；MgSO4·
7H2O，0.02g；NaCl，0.1g；CaCl2，0.008g；，NaAc 4g；生长因子，1mL；微量元素，1mL；蒸馏水，98mL；pH值用磷酸调节为7.0。
[0006]在本专利技术的优选的实施方式中，步骤（3）中，超声频率为30KHz，功率为2.0Kw，超声时间为40min。
[0007]在本专利技术的优选的实施方式中，步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基与步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液的体积比为12.5
‑
50：1，优选为25:1。
[0008]在本专利技术的优选的实施方式中，步骤（5）中，在配置的溶液中添加松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮过滤液，按质量百分比计为，松树叶：刺五加叶：虎杖=4:4:1～20:20:1，其中松树叶、刺五加叶与虎杖物质水分含量低于30%。
[0009]在本专利技术的优选的实施方式中，松树叶、刺五加叶和虎杖蒸煮液的制备方法如下：1L蒸馏水添加松树叶、五加叶、虎杖量为20g、20g和5g粉末物，然后高温高压蒸煮熬制，熬制液经10000rmp超速离心10min 获得上清液，将上清液添加到步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。
[0010]在本专利技术的优选的实施方式中，高温高压蒸煮时，压强为1.5Mpa，温度100℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高淡紫链霉菌海南变种产中生菌素效价的方法，其特征在于，通过在淡紫链霉菌海南变种产中生菌素的发酵培养基依次添加沼泽红假单胞菌滤膜处理液、松树叶、刺五加和虎杖蒸煮液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）配制沼泽红假单胞菌培养液培养沼泽红假单胞菌；（2）培养沼泽红假单胞菌，培养条件为：用低温保存的培养基接种沼泽红假单胞菌，在室温下培养，采用4500
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5000Lx的光照强度，在培养过程中，每天的光照环境24小时，培养5
‑
7d，沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05
‑
1.50
×
10
9 cell/mL；（3）当培养的沼泽红假单胞菌最高浓度为1.05
‑
1.50
×
10
9 cell/m L时，收集沼泽红假单胞菌，超声破碎沼泽红假单胞菌，超声频率为20
‑
40KHz，功率为1
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4.0Kw，超声时间为30
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60min，然后0.22μm微孔滤膜过滤，得到沼泽红假单胞菌滤膜处理液；（4）配置淡紫链霉菌海南变种发酵培养基；（5）上述步骤（3）的沼泽红假单胞菌滤膜处理液添加步骤（4）的淡紫链霉菌海南变种发酵培养基中去，作为淡紫链霉菌海南变种发酵培养基备用。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，沼泽红假单胞菌培养基配方：谷氨酸钠0.169g；K2HPO4，0.05g；KH2PO4，0.05g；乙二胺四乙酸二钠，0.02g；MgSO4·
7H2O，0.02g；NaCl，0.1g；CaCl2，0.008g；，NaAc 4g；生长因子，1
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2mL；微量元素，1
‑
2mL；蒸馏水，96
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98mL；pH调节为7.0；和/或生长因子组成如下：维生素B1，0.0005
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0.002mg；尼克酸0.05
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0.25mg；对氨基苯甲酸，0.05
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0.3mg；生物素，0.0005
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0.002mg；蒸馏水1000mL；过滤除菌；和/或微量元素组成如下：FeCl3·
6H2O 4
‑
10mg；CuSO4·
6H2O 0.01
‑
0.09mg；H3BO4，0.5
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1.5mg；MnCl2·
4H2O，0.01
‑
0.09mg；ZnSO4·
7H2O，0.5
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1.5mg；Co(NO3)
·
6H2O，0.1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘忠成，翁婧，陈豪，周晶晶，师维，李蒲民，
申请(专利权)人：陕西麦可罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：