【技术实现步骤摘要】
一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法
[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法。
技术介绍
[0002]16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。通过检测16S rDNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。近些年来，基于二代测序的16S rDNA检测大大加速了人们对微生物群落的了解。但由于二代测序的读长限制，目前微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某段或某几段高变区，物种分类也只能精确到属水平。无法将其准确注释到物种水平。Sanger测序虽能接近全长，但通量低，且成本高，不适用群体复杂的环境微生物宏样本。随着三代SMRT测序技术的出现，PacBio全长16S rDNA测序集合了Sanger测序的读长优势和二代测序的高通量优势，具有和二代测序...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5
’
端带有标签序列，并且5
’
端磷酸化修饰，每对引物的3
’
端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；S2、扩增子样本的扩增：S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384
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12模式，喷液体积100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入5184孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600x g离心5分钟；S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄福义，林晨烁，苏建强，张娴，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：
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