一种基于Pacbio测序的16SrDNA全长文库高通量构建的技术方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，公开了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：引物的5

【技术实现步骤摘要】
一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法。

技术介绍

[0002]16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。通过检测16S rDNA可变区的序列变异和丰度，可了解环境样品中群落多样性信息，在微生物分类鉴定、微生态研究等方面起着重要的作用。近些年来，基于二代测序的16S rDNA检测大大加速了人们对微生物群落的了解。但由于二代测序的读长限制，目前微生物多样性研究仅检测16S rDNA的某段或某几段高变区，物种分类也只能精确到属水平。无法将其准确注释到物种水平。Sanger测序虽能接近全长，但通量低，且成本高，不适用群体复杂的环境微生物宏样本。随着三代SMRT测序技术的出现，PacBio全长16S rDNA测序集合了Sanger测序的读长优势和二代测序的高通量优势，具有和二代测序相媲美的准确度和重复性，可提供更准确的物种分类和更多的物种鉴定，在系统发育、群落鉴定和代谢通路预测方面都更有优势。
[0003]常规的PacBio全长16S rDNA基因的文库构建是通过带有标签序列的PCR引物扩增16S全长基因，然后每个扩增产物需采用AMPure磁珠纯化，进行Qubit浓度测定，确定PCR产物的浓度与总量。从而等量混合，混合样本再经过DNA损伤修复，末端修复加A，再与测序接头相连接，获得基于PacBio测序平台的全长扩增子文库。这种方法对于少量样本而言，操作简便，测序结果较好，价格偏低。随着微生物研究的逐渐深入以及测序价格的降低，目前出现了很多基于大量样本的微生物群落研究。常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高。
[0004]因此，需要一种高通量、低成本、速度快、质量好的基因文库构建技术方法来解决以上问题。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，解决了常规的16S rDNA的文库构建方法对于大量样本而言，建库过程繁琐，周期长，成本相对较高的问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，包括以下步骤：
[0009]S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5
’
端带有标签序列，并且5
’
端磷酸化修饰，每对引物的3
’
端为扩增子
的特异性引物，引物采用HPLC纯化；
[0010]S2、扩增子样本的扩增：
[0011]S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；
[0012]S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384
×
12模式，喷液体积为100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；
[0013]S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入51 84孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600xg离心5分钟；
[0014]S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；
[0015]S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；
[0016]S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；
[0017]S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；
[0018]S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；
[0019]S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；
[0020]S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。
[0021]优选的，所述步骤S1中，引物结构从5
’
端到3
’
端分别为5nt的缓冲序列
‑
16nt标签序列
‑
16S特异性引物，并且5
’
端在合成时需要进行磷酸化修饰。
[0022]优选的，所述步骤S2.1反应液为：10ng/μL的样本DNA 1.5μL、10μM带标签的扩增引物F 0.75μL、10μM带标签的扩增引物R 0.75μL、2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 7.5μL、灭菌超纯水4.5μL。
[0023]优选的，所述带标签的扩增引物F和到标签的扩增引物R的组合对应一种样本，不同样本使用不同组合，以便后续测序后的拆分，重复孔使用同一种组合。
[0024]优选的，所述步骤S2.2中PCR扩增反应程序为：95℃10min，25个循环
×
(95℃30s，57℃30s，72℃90s)，72℃5min。
[0025]优选的，所述步骤S2.4中，PCR仪热盖温度需设定为72℃。
[0026]优选的，所述步骤S5和S6中的DNA损伤修复和末端修复加A以及步骤S7中连接接头所用试剂均来源于SMRTbell Express Template Prep 2.0试剂盒。
[0027](三)有益效果
[0028]本专利技术提供了一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，具备以下有益效果：
[0029](1)、本专利技术通过MSND点样仪以一张含有5184个反应孔的芯片作为载体，仅需在384孔板中配制各样本的扩增反应体系，MSND点样仪即可自动完成芯片制备，同时在扩增结
束后通过收集装置将各个扩增产物混合至一个离心管中进行纯化，而不需要对每个扩增产物进行纯化，浓度测定再混库。大大地简化了实验操作流程，提高了建库效率，降低了建库成本。
[0030](2)、本专利技术采用自动化仪器最多可同时进行384个样本的建库，提高了样本的通量；大大提升工作效率，且可根据对每个样本扩增产物需要量的不同，灵活调整模式。即设置重复数不同。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Pacbio测序的16S rDNA全长文库高通量构建的技术方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5
’
端带有标签序列，并且5
’
端磷酸化修饰，每对引物的3
’
端为扩增子的特异性引物，引物采用HPLC纯化；S2、扩增子样本的扩增：S2.1、配置反应液：取一个经过灭菌并烘干的384孔板，在孔内配置芯片制备的反应液；S2.2、设置仪器：将MSDN点样仪的模式选为384
×
12模式，喷液体积100nl。其中384代表384个样本，12代表12次重复，即每个384孔板的孔内试剂会喷入芯片的12个孔中，每个芯片孔反应体系为100nl；S2.3、芯片制备：将配置好的384孔板放入MSND点样仪特定位置，将SmartChip芯片也放入到MSND点样仪特定位置，点击开始，MSND点样仪将自动把384孔板中的文库构建所需的PCR反应体系喷入5184孔SmartChip芯片孔内，待运行完成，将SmartChip芯片取下，盖上芯片膜，2600x g离心5分钟；S2.4、上机扩增：将SmartChip芯片放入PCR仪，盖上盖子进行PCR扩增；S3、收集扩增产物：PCR结束之后，将芯片取出，2600xg离心5分钟后小心撕掉芯片膜，避免膜的胶残留在芯片上；组装芯片配备的收集槽，将收集槽放置到附带的离心架上；将芯片倒扣在收集槽上，贴上封槽膜；2600xg离心10分钟，结束后，将离心管取下，做好标记；S4、用0.6倍的AMPure PB磁珠对扩增产物进行纯化；S5、取上述纯化产物500ng进行DNA损伤修复；S6、对步骤S5中产物进行末端修复和加A反应；S7、对步骤S6获得的产物与测序接头进行连接反应；S8、经0.6倍的AMPure PB磁珠纯化步骤S7得到的连接产物后，即可得到基于PacBio测序平台的扩增子混样测...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄福义，林晨烁，苏建强，张娴，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：