用于分析核酸的方法和组合物技术

本技术部分涉及用于分析核酸的方法和组合物。在一些方面，本技术涉及用于从单链核酸片段制备核酸文库的方法和组合物。片段制备核酸文库的方法和组合物。片段制备核酸文库的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于分析核酸的方法和组合物
[0001]相关专利申请
[0002]本专利申请要求2019年4月5日提交的美国临时专利申请号62/830,211的权益，其名称为METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACID(用于分析核酸的方法和组合物)，Kelly M.HARKINS KINCAID等为专利技术人，并且指定的代理师案卷编号为CBS
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2002
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PV。本专利申请还要求2019年6月14日提交的美国临时专利申请号62/861,594的权益，其名称为METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACID(用于分析核酸的方法和组合物)，Kelly M.HARKINS KINCAID等为专利技术人，并且指定的代理师案卷编号为CBS
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2002
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PV2。本专利申请还要求2019年10月23日提交的美国临时专利申请号62/925,132的权益，其名称为METHODS AND COMPOSITIONS FOR ANALYZING NUCLEIC ACID(用于分析核酸的方法和组合物)，Kelly M.HARKINS KINCAID等为专利技术人，并且指定的代理师案卷编号为CBS
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2002
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PV3。前述申请的全部内容通过引用并入本文，包括所有文本、表格和附图。


[0003]该技术部分涉及用于分析核酸的方法和组合物。在一些方面，该技术涉及用于从单链核酸片段制备核酸文库的方法和组合物。

技术介绍

[0004]活生物体(例如动物、植物和微生物)的遗传信息和其他形式的复制遗传信息(例如病毒)编码于核酸(即脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))中。遗传信息是一连串代表化学核酸或假定核酸的一级结构的核苷酸或修饰的核苷酸。
[0005]多种高通量测序平台用于核酸分析。例如，ILLUMINA平台涉及衔接子连接的DNA片段的克隆扩增。另一个平台是基于纳米孔的测序，它依赖于通过小通道转移核酸分子或单独的核苷酸。用于某些测序平台的文库制备通常包括DNA片段化、片段末端修饰和衔接子连接，并且可能包括核酸片段的扩增(例如PCR扩增)。
[0006]为特定类型的核酸分析选择合适的测序平台需要详细了解可用技术，包括错误来源、错误率以及测序速度和成本。虽然测序成本已经降低，但文库制备的通量和成本可能是一个限制因素。文库制备的一方面包括修饰核酸片段的末端，使得它们适合特定的测序平台。核酸末端可能含有有用信息。因此，修饰核酸末端(例如，用于文库制备)同时保留核酸末端所含信息的方法，对于处理和分析核酸将是有用的。
[0007]文库制备的另一方面包括捕获单链核酸片段。在某些情况下，与传统的双链DNA(dsDNA)制备方法相比，单链文库制备方法可以生成更好、更复杂的文库。产生单链DNA(ssDNA)文库的缺点包括劳动密集、昂贵且耗时的方案，以及外来或定制试剂要求。因此，无需劳动密集、昂贵且耗时的方案和/或外来或定制试剂的情况下捕获单链核酸(例如，用于文库制备)的方法，对于处理和分析核酸(例如，单链核酸、变性双链核酸或含有单链核酸的混合物)将会是有用的。
[0008]文库制备的另一方面包括捕获单链RNA片段。通常，现有RNA文库制备方法不仅需
要使用逆转录酶从RNA合成第一链DNA，还需要合成第二链，以制备与下游双链测序衔接子连接相容的cDNA分子。通常，需要生成链特异RNA测序文库，以便准确评估转录本从哪条基因组DNA链转录而来。为了创建链特异RNA测序文库，方法可以包括在测序衔接子连接后降解第二DNA链。然而，在RNA预降解之前进行第二链DNA合成是有问题的，因为它会产生第三链合成副产物，并且有时产生第四链合成副产物，这些副产物会使所得的RNA测序数据复杂化，并部分混淆文库的链特异性。因此，无需第二链合成即可捕获单链RNA(例如，用于文库制备)的方法，对于处理和分析含有RNA的核酸会是有用的。

技术实现思路

[0009]在一些方面提供了用于产生核酸文库的方法，包括组合(i)包含单链核酸(ssNA)的核酸组合物、(ii)第一寡核苷酸和(iii)多个第一支架多核苷酸种类，其中(a)所述多个第一支架多核苷酸种类中的每种多核苷酸都包含ssNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区；和(b)所述核酸组合物、所述第一寡核苷酸和所述多个第一支架多核苷酸种类在以下条件下组合，其中所述第一支架多核苷酸种类的分子与(i)第一ssNA末端区和(ii)所述第一寡核苷酸的分子杂交，从而形成所述第一寡核苷酸的分子的末端与所述第一ssNA末端区的末端相邻的杂交产物。在一些方面，方法包括在组合之前，使所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类与包含磷酸酶活性的试剂在以下条件下接触：其中所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类被去磷酸化，从而生成去磷酸化的第一寡核苷酸和/或去磷酸化的第一支架多核苷酸种类。在一些方面，方法是用于从ssNA产生文库的无SSB方法。
[0010]在一些方面还提供了组合物，该组合物包含：核酸组合物，该核酸组合物包含单链核酸(ssNA)；第一寡核苷酸；和多个第一支架多核苷酸种类，每个种类都包含ssNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区。
[0011]在一些方面还提供了试剂盒，该试剂盒包含：第一寡核苷酸、多个第一支架多核苷酸种类，每个种类都包含ssNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区；以及使用所述第一寡核苷酸和所述多个第一支架多核苷酸种类产生核酸文库的说明。
[0012]在一些方面提供了用于产生核酸文库的方法，包括组合(i)包含单链核糖核酸(ssRNA)或单链互补脱氧核糖核酸(sscDNA)的核酸组合物，(ii)第一寡核苷酸，和(iii)多个第一支架多核苷酸种类，其中(a)所述多个第一支架多核苷酸种类中的每种多核苷酸都包含ssRNA或sscDNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区；和(b)所述核酸组合物、所述第一寡核苷酸和所述多个第一支架多核苷酸种类在以下条件下组合，在该条件中，所述第一支架多核苷酸种类的分子与(i)第一ssRNA或sscDNA末端区和(ii)所述第一寡核苷酸的分子杂交，从而形成所述第一寡核苷酸的分子的末端与所述第一ssRNA或sscDNA末端区的末端相邻的杂交产物。在一些方面，方法包括在组合之前，使所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类与包含磷酸酶活性的试剂在以下条件下接触：其中在所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类被去磷酸化，从而生成去磷酸化的第一寡核苷酸和/或去磷酸化的第一支架多核苷酸种类的条件下。在一些方面，方法是用于从ssRNA或sscDNA产生文库的无SSB方法。
[0013]在一些方面还提供了组合物，该组合物包含：包含单链核糖核酸(ssRNA)或单链互
England Biolabs Ultra II RNA第一链合成组件(商业方案)合成。i和ii是内部方案的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生核酸文库的方法，包括：组合(i)包含单链核酸(ssNA)的核酸组合物、(ii)第一寡核苷酸和(iii)多个第一支架多核苷酸种类，其中：(a)所述多个第一支架多核苷酸种类中的每种多核苷酸都包含ssNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区；(b)所述核酸组合物、所述第一寡核苷酸和所述多个第一支架多核苷酸种类在以下条件下组合，在所述条件中，所述第一支架多核苷酸种类的分子与(i)第一ssNA末端区和(ii)第一寡核苷酸分子杂交，从而形成其中所述第一寡核苷酸分子的末端与所述第一ssNA末端区的末端相邻的杂交产物；和(c)在所述组合之前或组合过程中，所述ssNA不与单链核酸结合蛋白(SSB)组合。2.如权利要求1所述的方法，进一步包括在所述组合之前，在所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类去磷酸化的条件下，使所述第一寡核苷酸和/或所述多个第一支架多核苷酸种类与包含磷酸酶活性的试剂接触，从而生成去磷酸化的第一寡核苷酸和/或去磷酸化的第一支架多核苷酸种类。3.一种产生核酸文库的方法，包括：在第一寡核苷酸和多个第一支架多核苷酸种类去磷酸化的条件下，使所述第一寡核苷酸和所述多个第一支架多核苷酸种类与包含磷酸酶活性的试剂接触，从而生成去磷酸化的第一寡核苷酸和多个去磷酸化的第一支架多核苷酸种类；和组合(i)包含单链核酸(ssNA)的核酸组合物、(ii)所述去磷酸化的第一寡核苷酸和(iii)所述多个去磷酸化的第一支架多核苷酸种类，其中：(a)所述多个第一支架多核苷酸种类中的每种多核苷酸都包含ssNA杂交区和第一寡核苷酸杂交区；和(b)所述核酸组合物、所述去磷酸化的第一寡核苷酸和所述去磷酸化的多个第一支架多核苷酸种类在以下条件下组合，在所述条件中，所述第一支架多核苷酸种类的分子与(i)第一ssNA末端区和(ii)所述第一寡核苷酸分子杂交，从而形成其中所述第一寡核苷酸分子的末端与所述第一ssNA末端区的末端相邻的杂交产物。4.如权利要求3所述的方法，其中在所述组合之前或所述组合过程中，所述ssNA不与单链核酸结合蛋白(SSB)组合。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述所述的方法，进一步包括在组合之前，在所述ssNA去磷酸化的条件下，使所述ssNA与包含磷酸酶活性的试剂接触，从而生成去磷酸化的ssNA；和将第二寡核苷酸共价连接于所述ssNA的5
′
末端，其中(i)所述第二寡核苷酸在3
′
末端包含磷酸酯，和(ii)所述第二寡核苷酸的共价连接包括，在所述ssNA的5
′
末端共价连接至所述第二寡核苷酸的3
′
末端的条件下，使所述ssNA和所述第二寡核苷酸与包含单链连接酶活性的试剂接触。6.如权利要求1
‑
4中任一项所述所述的方法，进一步包括将所述核酸组合物与(iv)第二寡核苷酸和(v)多个第二支架多核苷酸种类组合，其中：(c)所述多个第二支架多核苷酸种类中的每种多核苷酸都包含ssNA杂交区和第二寡核苷酸杂交区；和
(d)所述核酸组合物、所述第二寡核苷酸和所述多个第二支架多核苷酸种类在以下条件下组合，在所述条件中，所述第二支架多核苷酸种类的分子杂交至(i)第二ssNA末端区和(ii)所述第二寡核苷酸分子，从而形成其中所述第二寡核苷酸分子的末端与所述第二ssNA末端区的末端相邻的杂交产物。7.如权利要求6所述的方法，进一步包括在所述组合之前，在所述第二寡核苷酸和/或所述多个第二支架多核苷酸种类去磷酸化的条件下，使所述第二寡核苷酸和/或所述多个第二支架多核苷酸种类与包含磷酸酶活性的试剂接触，从而生成去磷酸化的第二寡核苷酸和/或去磷酸化的第二支架多核苷酸种类。8.如权利要求6或7所述的方法，其中在所述组合之前，使每个所述第一支架多核苷酸种类与第一寡核苷酸杂交以形成多个第一支架双链体种类，并且使每个所述第二支架多核苷酸种类与第二寡核苷酸杂交以形成多个第二支架双链体种类。9.如权利要求6
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8中任一项所述的方法，进一步包括共价连接所述第一寡核苷酸和所述第一ssNA末端区的相邻末端，并共价连接所述第二寡核苷酸和所述第二ssNA末端区的相邻末端，从而生成共价连接的杂交产物。10.如权利要求9所述的方法，其中所述共价连接包括，在所述第一ssNA末端区的末端共价连接至所述第一寡核苷酸的末端且所述第二ssNA末端区的末端共价连接至所述第二寡核苷酸的末端的条件下，使所述杂交产物与包含连接酶活性的试剂接触。11.如权利要求8所述的方法，其中所述多个第一支架双链体种类中的一些或所有双链体在所述第一寡核苷酸的5
′
末端包含腺苷酰化修饰，并且在不存在ATP的情况下，将所述多个第一支架双链体种类与所述ssNA组合并共价连接，从而形成中间共价连接的杂交产物。12.如权利要求11所述的方法，其中将所述中间共价连接的杂交产物与所述多个第二支架双链体种类和ATP组合并共价连接，从而形成共价连接的杂交产物。13.如权利要求9
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12中任一项所述的方法，其中所述组合和所述共价连接进行30分钟或更短。14.如权利要求9
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13中任一项所述的方法，其中在单个容器中进行所述组合和所述共价连接。15.如权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中每个所述第一多核苷酸种类的ssNA杂交区都不同于所述多个第一多核苷酸种类中其他第一多核苷酸种类中的ssNA杂交区。16.如权利要求6
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15中任一项所述的方法，其中每个所述第二多核苷酸种类的ssNA杂交区都不同于所述多个第二多核苷酸种类中其他第二多核苷酸种类中的ssNA杂交区。17.如权利要求1
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16中任一项所述的方法，其中所述ssNA杂交区包含随机序列。18.如权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述ssNA杂交区包含一个或多个通用碱基。19.如权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中：a)所述第一寡核苷酸包含以下中的一种或多种(i)第一引物结合结构域，(ii)第一测序衔接子或其部分，(iii)唯一分子标识符(UMI)，以及(iv)索引；和
b)所述第一寡核苷酸杂交区包含以下中的一种或多种：(i)与所述第一引物结合结构域互补的多核苷酸，(ii)与所述第一测序衔接子或其部分互补的多核苷酸，(iii)与所述唯一分子标识符(UMI)互补的多核苷酸，以及(iv)与所述索引互补的多核苷酸。20.如权利要求6
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19中任一项所述的方法，其中：a)所述第二寡核苷酸包含以下中的一种或多种(i)第二引物结合结构域，(ii)第二测序衔接子或其部分，(iii)唯一分子标识符(UMI)，以及(iv)索引；和b)所述第二寡核苷酸杂交区包含以下中的一种或多种(i)与所述第二引物结合结构域互补的多核苷酸，(ii)与所述第二测序衔接子或其部分互补的多核苷酸，(iii)与所述唯一分子标识符(UMI)互补的多核苷酸，以及(iv)与所述索引互补的多核苷酸。21.如权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸，一些或所有的所述第一支架多核苷酸种类包含一个或多个修饰的核苷酸，或者所述第一寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸并且一些或所有的所述第一支架多核苷酸种类包含一个或多个修饰的核苷酸。22.如权利要求6
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21中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸，一些或所有的所述第二支架多核苷酸种类包含一个或多个修饰的核苷酸，或者所述第二寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸并且一些或所有的所述第二支架多核苷酸种类包含一个或多个修饰的核苷酸。23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述一个或多个修饰的核苷酸能够阻断所述寡核苷酸与另一寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子的共价连接。24.如权利要求21、22或23所述的方法，其中所述寡核苷酸在不与所述ssNA相邻的末端包含所述一个或多个修饰的核苷酸。25.如权利要求21
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24中任一项所述的方法，其中所述一个或多个修饰的核苷酸能够阻断所述支架多核苷酸与另一寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子的共价连接。26.如权利要求21
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25中任一项所述的方法，其中所述支架多核苷酸在所述多核苷酸的一个末端或两个末端包含所述一个或多个修饰的核苷酸。27.如权利要求21
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26中任一项所述的方法，其中所述一个或多个修饰的核苷酸包含连接阻断修饰。28.如权利要求9
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27中任一项所述的方法，进一步包括使所述共价连接的杂交产物变性，从而生成单链连接产物。29.如权利要求28所述的方法，进一步包括，在第三寡核苷酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的二聚体杂交的条件下，将所述单链连接产物与所述第三寡核苷酸组合，从而形成寡核苷酸二聚体杂交产物。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述寡核苷酸二聚体杂交产物包含切割位点。31.如权利要求30所述的方法，其中所述切割位点是限制酶识别位点。32.如权利要求29
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31中任一项所述的方法，进一步包括使所述寡核苷酸二聚体杂交产物与切割剂接触。33.如权利要求6
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32中任一项所述的方法，其中所述第一支架多核苷酸种类和/或所述第二支架多核苷酸种类包含DNA。34.如权利要求6
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【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：克拉雷特生物科学有限责任公司，
类型：发明
国别省市：