高通量测序标准物质及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种高通量测序标准物质及其制备方法和应用，属于基因检测技术领域。该标准物质模拟治疗前的肿瘤(血液肿瘤)样本或细胞系在经过TCR/BCR克隆重排鉴定有相应可追踪的疾病marker克隆，即为阳性CDR3序列，在治疗后不同时间段产生的各种MRD克隆水平。用以对NGS检测MRD的方法进行技术评价，以确保检测准确性。确性。确性。

【技术实现步骤摘要】
高通量测序标准物质及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种高通量测序标准物质及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)是指恶性肿瘤经过治疗后体内残留的微量肿瘤细胞的状态，是肿瘤复发的根源。MRD的水平一般比较低，需要用敏感性和特异性都非常高的方法来进行检测。
[0003]免疫组库(Immune Repertoire，IR)被定义为在任何特定时间下，机体适应性免疫系统的T淋巴细胞表面受体(T cell receptor，TCR)和B淋巴细胞表面受体(B cell receptor，BCR)的总和。在T/B细胞成熟过程中，会发生VDJ基因的重排，在重排过程中随机选取一种V、D和J基因串联在一起，组成TCR/BCR的可变区，同时还会在接合部位发生碱基的随机的插入和删除，因此几乎每个新产生的T/B细胞的TCR/BCR基因都各不相同，组成数量庞大的TCR/BCR免疫组库，赋予机体识别各种不同抗原的能力。通过高通量测序对TCR/BCR的编码基因进行分析，可以对免疫组库进行解码，用于对免疫系统的多样性和特异性进行分析。
[0004]基于BCR/TCR重排进行检测，适用于95％以上的MRD病例。在分析足够数量的细胞时可增强敏感性(检出频率约达10
‑5‑
10
‑6水平)，同时可用于分析免疫系统多样性、免疫重建等，质量比较稳定，但是使用的校准仪、质量控制和正确解释NGS数据指南仍然缺乏。
[0005]由此可见，用NGS检测MRD，其在灵敏度方面更具优势，因而从检测准确性考量，需要一种评价NGS检测MRD技术的标准物质，方便对技术的标准流程进行规范，对技术的重复性、精密度、线性等性能指标进行评估。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要针对上述问题，提供一种高通量测序标准物质，可采用该标准物质对NGS检测MRD的方法进行技术评价，以确保检测准确性。
[0007]一种高通量测序标准物质，包括定量的阳性标准物质，所述阳性标准物质通过以下方法得到：
[0008]阳性样本处理：收集肿瘤患者生物样本为阳性样本，提取DNA作为标准物质；
[0009]高通量测序：取上述DNA标准物质，建库进行高通量测序，通过序列比对获得阳性CDR3序列；
[0010]sanger验证：以sanger测序方法验证上述阳性CDR3序列，确认所述高通量测序结果与sanger测序结果一致；
[0011]定量检测：获得所述阳性样本中阳性CDR3序列的定量值，同时对内参基因进行检测，获得内参基因序列的定量值；
[0012]制备阳性标准物质：通过所述阳性CDR3序列的定量值和所述内参基因序列的定量
值，计算得到所述标准物质的目标克隆频率，再将此标准物质按照预定浓度进行稀释，即得阳性标准物质。
[0013]上述高通量测序标准物质，模拟治疗前的肿瘤(如血液肿瘤)样本或细胞系在经过TCR/BCR克隆重排鉴定有相应可追踪的疾病marker克隆(目标克隆)，即为阳性CDR3序列，在治疗后不同时间段产生的各种MRD克隆水平。MRD克隆水平指marker克隆的频率，在模拟不同MRD水平的样本中，使用带marker的样本或细胞系混到不含marker的背景里(混合物)，不含marker的背景一般为健康人DNA或人为模拟混合的健康人细胞，用来稀释marker克隆细胞，使marker频率达到理论值。
[0014]其中，带marker的样本或细胞系的来源可以是外周血、骨髓、组织。健康人DNA的来源也可以是相应的外周血、骨髓、组织。再用sanger对测序结果进行验证，同时以探针法ddPCR对混合物的marker克隆进行绝对定量，确定混合物的实际值，得到已知marker克隆频率的混合物即标准物质，可用此标准物质对高通量测序MRD检测方法进行评估，考察其准确性、重复性、灵敏度和线性等性能指标。
[0015]在其中一个实施例中，所述制备阳性标准物质步骤中，采用内参基因ALB定量总有核细胞数量，以ddPCR定量含有目标克隆的细胞数量，并通过下述公式计算得到目标克隆频率：
[0016][0017]在其中一个实施例中，按照6.5
±
1pg DNA/细胞的量计算样本中细胞数量。可以理解的，上述换算比例按照以下方法推导：单个细胞中有一对染色体，每对染色体含1份基因组，1份基因组的碱基对数量L约2.9
×
109bp～3.0
×
109bp，每bp平均分子量为660g/mol，阿伏伽德罗常数N
A
＝6.02
×
10
23
mol
‑1，由此计算1个有核细胞里的基因组重量m公式如下：
[0018]m＝n
×
M＝2/N
A
×
660
×
L
[0019]再根据上述1个有核细胞里的基因组重量m约为6.5pg反推细胞数量。
[0020]在其中一个实施例中，该标准物质还包括阴性标准物质、精密度标准物质、最低检出限标准物质和线性标准物质中的至少一种；
[0021]所述阴性标准物质中目标克隆频率为0；
[0022]所述精密度标准物质中目标克隆频率为10
‑3‑
10
‑6数量级；
[0023]所述最低检出限标准物质中目标克隆频率为10
‑6数量级；
[0024]所述线性标准物质中目标克隆频率为10
‑1‑
10
‑6数量级。
[0025]可以理解的，上述“数量级”表示频率大小的级别，如10
‑6数量级表示1.0
×
10
‑6至小于1.0
×
10
‑5的频率，或理解为1.0
×
10
‑6至其中，9为循环小数。
[0026]根据目前的研究，常规技术中，经验证的NGS MRD检测的频率灵敏度为10
‑6，因此，上述标准物质中将目标marker克隆频率设计为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6，即用阳性样本DNA混到健康人的DNA里，先形成频率为10
‑1的混合物，然后再用健康人DNA(阴性标准物质)进行梯度稀释，使目标克隆频率分别为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6，分别形成用于精密度评估的标准物质、用于最低检出限评估的标准物质和用于线性评估的标准物质。
[0027]在其中一个实施例中，所述阴性标准物质为健康人外周血单核细胞。
[0028]在其中一个实施例中，所述阳性标准物质包括：
[0029]强阳标准物质，其中目标克隆频率＞10
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量测序标准物质，其特征在于，包括定量的阳性标准物质，所述阳性标准物质通过以下方法得到：阳性样本处理：收集肿瘤患者生物样本为阳性样本，提取DNA作为标准物质；高通量测序：取上述DNA标准物质，建库进行高通量测序，通过序列比对获得阳性CDR3序列；sanger验证：以sanger测序方法验证上述阳性CDR3序列，确认所述高通量测序结果与sanger测序结果一致；定量检测：获得所述阳性样本中阳性CDR3序列的定量值，同时对内参基因进行检测，获得内参基因序列的定量值；制备阳性标准物质：通过所述阳性CDR3序列的定量值和所述内参基因序列的定量值，计算得到所述标准物质的目标克隆频率，再将此标准物质按照预定浓度进行稀释，即得阳性标准物质。2.根据权利要求1所述的高通量测序标准物质，其特征在于，所述制备阳性标准物质步骤中，采用内参基因ALB定量总有核细胞数量，以ddPCR定量含有目标克隆的细胞数量，并通过下述公式计算得到目标克隆频率：3.根据权利要求2所述的高通量测序标准物质，其特征在于，按照6.5
±
1pg DNA/细胞的量计算样本中细胞数量。4.根据权利要求1所述的高通量测序标准物质，其特征在于，还包括阴性标准物质、精密度标准物质、最低检出限标准物质和线性标准物质中的至少一种；所述阴性标准物质中目标克隆频率为...

【专利技术属性】
技术研发人员：林莉娅，武靖华，张伟，夏敏，陆世鑫，
申请(专利权)人：深圳泛因医学有限公司，
类型：发明
国别省市：