使用固相载体的核酸扩增方法技术

本发明专利技术的使用固相载体的核酸扩增法包括：将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上以在固相上进行互补链合成，通过核酸外切酶处理降解去除固相上的未反应的靶捕捉用核酸，之后进行mRNA降解和在链终止核苷酸三磷酸存在下的基于TdT反应的同聚物添加。根据本发明专利技术的方法，不受固相上酶与DNA底物的量比过高、反应时间过长、以及试剂批次差异的影响，由微量的样品即可稳定且高效地扩增cDNA。另外，根据本发明专利技术的扩增法，可扩大同时进行使用DNA标记抗体等用寡核酸标记的特异结合分子的分析和转录物的分析的技术的应用范围。分析的技术的应用范围。分析的技术的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用固相载体的核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及使用固相载体的核酸扩增方法。

技术介绍

[0002]近年来，已经使用各单个细胞等微量样品进行了网罗性基因表达分析。这种技术可实现单细胞RNA
‑
seq分析(单细胞转录组(single cell transcriptome：SCT)分析)，其网罗性地捕捉数百～万个单位的各个细胞的性质，关系到细胞群内的多态性的有无、或新的细胞亚群的鉴定、与病情相关的特殊的细胞群的鉴定，要在人类中制作单个细胞水平的图谱的国际项目于2016年启动(非专利文献1)等，成为以迄今为止所没有的分辨率推动生物学理解的原动力。
[0003]作为其他的代表性的微量样品，可列举：为了癌症患者的诊断而采集的原发灶/转移灶的活检样本中所含的肿瘤浸润T细胞。从抗PD
‑
1抗体等作为免疫疗法的本质的CTL的实际状态为CD8
+ T细胞的观点来看，测定具有癌抗原特异性识别能力的CD8
+
T细胞被诱导到何种程度的方法备受关注(非专利文献2)。作为其测定方法之一，有下述方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.使用固相载体的核酸扩增方法，该方法包括以下步骤：靶核酸捕捉步骤，经由固相载体上所结合的靶捕捉用核酸，将包含mRNA的靶核酸捕捉到固相载体上；互补链合成步骤，由捕捉到固相载体上的靶核酸合成包含cDNA的与靶核酸互补的DNA链；核酸外切酶处理步骤，通过核酸外切酶处理降解去除未捕捉靶核酸的固相载体上的靶捕捉用核酸；mRNA降解步骤，利用RNA降解酶来降解mRNA；同聚物添加步骤，在dATP、dTTP、dCTP或dGTP和链终止核苷酸三磷酸的存在下进行基于末端脱氧核苷酸转移酶的反应，在上述互补的DNA链的末端添加核苷酸同聚物；第2链合成步骤，使用包含与上述核苷酸同聚物互补的同聚物部分的第2链合成用引物，对固相上所结合的上述互补的DNA链进行第2链合成；以及核酸扩增步骤，以在固相载体上合成的双链DNA为模板进行核酸扩增反应。2.权利要求1所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP、ddNTP的衍生物、3
’‑
dNTP、或3
’‑
脱氧
‑5‑
甲基尿苷
‑5’‑
三磷酸。3.权利要求2所述的方法，其中，ddNTP的衍生物为3
’
位用不具有OH基的原子团修饰而得的ddNTP。4.权利要求1所述的方法，其中，链终止核苷酸三磷酸为ddNTP。5.权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，mRNA降解步骤和同聚物添加步骤同时进行实施。6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，在同聚物添加步骤中，进行polyC添加或polyG添加。7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，靶捕捉用核酸含有包含polyT部分的核酸。8.权利要求7所述的方法，其中，靶捕捉用核酸在polyT部分的5
’
侧包含第1接头部分。9.权利要求8所述的方法，其中，固相载体为珠粒，靶捕捉用核酸在第1接头部分与polyT部分之间包含珠粒识别条形码部分。10.权利要求8所述的方法，其中，固相载体为板，靶捕捉用核酸被固定在板的多处的分区上，在第1接头部分与polyT部分之间包含分区识别条形码部分。11.权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，第2链合成用引物在互补的同聚物部分的5
’
侧含有包含第2接头部分的引物。12.权利要求11所述的方法，其中，第2链合成用引物在第2接头部分与互补的同聚物部分之间包含分子条形码部分。13.权利要求8～12中任一项所述的方法，其中，在核酸扩增步骤中，使...

【专利技术属性】
技术研发人员：松岛纲治，上羽悟史，七野成之，伊藤哲，青木宽泰，
申请(专利权)人：学校法人东京理科大学，
类型：发明
国别省市：