多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用技术

本发明专利技术提供了多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用。支持物包括支持物本体以及位于支持物本体表面和/或内部的多种核酸标记，单个支持物上标记的核酸至少包括：一或多个第一核酸标记，其作用至少包括捕获反应体系中的特定化合物到支持物表面；一或多个第二核酸标记，其作用至少包括可以参与到捕获到支持物表面的特定化合物的指定生物化学反应过程。本发明专利技术的多种核酸共标记的支持物可以用于5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用


[0001]本专利技术是关于一种多种核酸共标记支持物及其制作方法与应用。

技术介绍

[0002]传统的核酸分子反应，包括核酸杂交、延伸、扩增等反应都是在液相中进行的，液相为参与反应的核酸和酶反应提供了均一稳定的环境从而能够最大化产出。随着生物研究的逐渐深入，科学家发现将参与反应的核酸或者酶连接到固相表面可以赋予核酸空间位置信息从而更方便纯化、分离、检测与分析，因此开发出越来越多的固相核酸反应用于核酸序列分析和核酸定量，例如寡核苷酸有序固定在基质上的核酸芯片技术、应用于二代基因测序的桥式扩增和微球乳液扩增技术、应用于高通量单细胞测序的核酸编码微珠等。
[0003]单核苷酸多态(SNP)作为遗传标记广泛应用于群体基因组学、全基因组关联研究(GWAS)、亲子鉴定和人群鉴定。传统的SNP鉴定技术可以同时分析数百个以内的位点，包括TaqMan荧光分析、KASPar鉴定技术以及直接PCR测序技术，优点在于在待检测SNP位点数量较少时实验操作灵活，缺点是单个样本待检测SNP数量多时(尤其≥50)成本线性增加；包括生物芯片和高通量测序在内的新检测技术可以实现103‑
106个SNP的鉴定，例如RAD测序(restriction site associated DNA sequencing)、外显子测序和全基因组测序，其缺点在于单个样本检测建库与测序成本较高，尤其在单个样本检测SNP数量少于1000时单个SNP平均检测成本迅速增加；当单个样本待检测SNP数量在20
‑r/>1000时使用多重PCR建库结合二代测序能够有效地降低单SNP平均检测成本。
[0004]多重PCR建库一般是指在PCR扩增体系中加入多对PCR引物以同时扩增多个目标片段，然后通过第二步通用引物扩增形成具有测序仪要求的含有接头和样本标签的核酸文库。由于在PCR扩增体系中加入较高浓度的多对引物，多重PCR容易形成大量的引物二聚体，而引物二聚体会直接影响构建文库的质量，所以如何去除引物二聚体成为多重PCR建库中的关键环节。据公开报道，Zuiyi Yang等人通过优化引物对序列可以降低多重PCR的引物二聚体，Integrated DNA Technologies公司、Adaptive Biotechnology公司以及Kenneth J.Livak实验室利用RNaseH依赖的PCR原理对多重PCR引物进行RNA碱基修饰也可以有效的降低反应过程中的引物二聚体。虽然引物二聚体可以通过以上披露的方法以及PCR后纯化去除，多重PCR还存在扩增目标区效率不同导致的PCR偏差以及引物对交叉组合导致的非特异扩增等问题。更重要的是，由于在液相条件中不同引物对的PCR扩增目标区域不能重叠，普通多重PCR很难在液相体系中实现单反应管长片段DNA的连续序列分析。
[0005]众所周知复杂的生命机体由许多性质特异的细胞组成，在特定的状态下每个细胞表达的核酸和蛋白的种类与数量都有所不同，所以在单细胞水平上检测核酸和蛋白指标对生物医学研究有重要意义。单细胞测序从检测指标来看主要有单细胞基因组测序、单细胞RNA测序、单细胞表观基因组测序及空间单细胞测序；从检测通量来看主要分为低通量单细胞测序(一次检测1
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500细胞)和高通量单细胞测序(一次检测1000
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10000细胞)。
[0006]高通量单细胞RNA检测主要有基于油包水的液滴区隔技术、基于微孔板的beads标
记技术以及微流控三种实现方式。基于油包水的液滴区隔技术以10X Genomics、Drop
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Seq平台及inDrop平台为代表。该类技术通过微流控技术将barcode标记的微珠和单个细胞包裹在个油滴中并裂解释放含有polyA尾巴的RNA；每一个凝胶微珠偶联了含有细胞标签和分子标签的oligo dT核酸序列；mRNA结合到细胞标签和分子标签的oligo dT核酸分子后通过逆转录给不同细胞来源的cDNA标记上不同的细胞标签并用于以后的混合建库并测序分析。基于微孔板的beads标技术以BD CytoSeq、SeqWell及microwell
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seq为代表。该技术将细胞自然沉降至细胞数量十倍以上的微孔阵列中保证单细胞入孔率，然后在微孔中加入细胞标签标记的微珠用以捕获细胞裂解后的mRNA；mRNA结合到细胞标签和分子标签的oligo dT后通过逆转录给不同细胞来源的cDNA标记上不同的细胞标签并用于以后的混合建库并测序分析。
[0007]液滴法通过油包水将细胞和标签微珠与其它细胞与微珠完全隔离，有效地降低了交叉污染的可能；同时除了可以实现3
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RNA表达谱文库外，液滴方案还可以将细胞标签和分子标签与模板转换序列偶联在一起从而实现5
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单细胞RNA表达谱测序；但由于液滴本身的不稳定性以及悬浮特性，基于液滴法的单细胞建库方案在RNA被细胞标签标记前后不能换液，从而减少了其进一步进行复杂反应的可能，尤其是缺少标签微珠的位置信息。微孔板法避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，有更好的细胞捕获效率；标签微珠落入微孔后具有固定的位置，可以进行更多的换液操作；但是由于微孔是顶部开放的半封闭结构会导致细胞RNA扩散出孔，因此目前所有的微孔法只能构建3
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单细胞RNA表达谱文库。

技术实现思路

[0008]本专利技术的一个目的在于提供一种多种核酸共标记的支持物。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种多种核酸共标记的支持物的制作方法。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供多种核酸共标记的支持物的应用。
[0011]本专利技术在支持物上修饰两种以上的核酸分子，其中一种核酸分子用于从反应池中捕获目的化合物并与共标记在同一固相化合物表面的其它类型分子一起参与特定的生物化学过程，包括但不限于多重PCR文库构建、单细胞RNA表达谱、单细胞转录组测序文库构建和单细胞多组学测序文库构建等应用方向。
[0012]具体而言，一方面，本专利技术提供了一种多种核酸共标记的支持物，其包括支持物本体以及位于支持物本体表面和/或内部的多种核酸标记，单个支持物上标记的核酸至少包括：一或多个第一核酸标记，其作用至少包括捕获反应体系中的特定化合物到支持物表面；一或多个第二核酸标记，其作用至少包括可以参与到捕获到支持物表面的特定化合物的指定生物化学反应过程。
[0013]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的多种核酸共标记的支持物中，所述支持物本体为固体珠子和/或半固态水凝胶珠。
[0014]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的多种核酸共标记的支持物，其为包括多个支持物的组合物。
[0015]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的多种核酸共标记的支持物中，同一支持物上的第一核酸标记、第二核酸标记的数量可以分别≥1个和/或≤10
13
个。
[0016]根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的多种核酸共标记的支持物中，同一支持本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多种核酸共标记的支持物，其包括支持物本体以及位于支持物本体表面和/或内部的多种核酸标记，单个支持物上标记的核酸至少包括：一或多个第一核酸标记，其作用至少包括捕获反应体系中的特定化合物到支持物表面；一或多个第二核酸标记，其作用至少包括可以参与到捕获到支持物表面的特定化合物的指定生物化学反应过程。2.根据权利要求1所述的多种核酸共标记的支持物，其中，所述支持物本体为固体珠子和/或半固态水凝胶珠。3.根据权利要求1所述的多种核酸共标记的支持物，其为包括多个支持物的组合物。4.根据权利要求3所述的多种核酸共标记的支持物，其中，同一支持物上的第一核酸标记、第二核酸标记的数量可以分别≥1个和/或≤10
13
个。5.根据权利要求3所述的多种核酸共标记的支持物，其中，同一支持物上的多个第一核酸标记的序列相同或不同；不同支持物上的第一核酸标记的序列相同或不同；同一支持物上的多个第二核酸标记的序列相同或不同；或不同支持物上的第二核酸标记的序列相同或不同。6.权利要求1～5任一项所述的多种核酸共标记的支持物的制作方法，该方法包括：将多种核酸通过接枝到和/或接枝于的方式标记到支持物本体上，得到多种核酸共标记的支持物。7.根据权利要求6所述的制作方法，其包括：将支持物本体和核酸分别修饰上能相互作用的功能单位，使二者反应将核酸标记到支持物本体上；按照预设好的核苷酸序列将核酸直接合成在支持物本体上；和/或采用生物化学反应进行核酸延伸或连接的方案在支持物本体上进行核酸标记。8.权利要求1～5任一项所述的多种核酸共标记的支持物在5
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单细胞RNA表达谱分析、构建微孔阵列平台的5
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单细胞VDJ文库、构建3
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单细胞RNA文库、构建单细胞转录组文库、单细胞多组学研究、多重PCR和/或构建多重PCR测序文库中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述的多种核酸共标记的支持物是用于5
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单细胞RNA表达谱分析：其中：支持物上固定有含有细胞标签与分子标签的模板转换序列以及RNA捕获序列，具体地，支持物上标记了至少两种核酸序列：第一核酸序列和第二核酸序列；第一核酸序列至少包含捕获序列，用于捕获目的核酸分子并作为引物延伸或逆转录；第二核酸序列包括细胞标签序列，细胞标签序列用于标记来源于同一细胞中的所有mRNA的分子；不同种类的支持物上具有不同的细胞标签；优选地，使得支持物在芯片的微孔中捕获单细胞裂解后释放的RNA，并在逆转录过程中通过模板转换实现对来源于同一细胞的RNA标记相同的细胞标签，而后通过扩增实现cDNA扩增并最终构建为5
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单细胞RNA表达谱文库。10.根据权利要求8所述的应用，其中，所述的多种核酸共标记的支持物是用于构建微孔阵列平台的5
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单细胞VDJ文库；其中：支持物上固定有含有细胞标签与分子标签的模板转换序列以及RNA捕获序列，具体地，支持物上标记了至少两种核酸序列：第一核酸序列和第二核酸序列；第一核酸序列至少包
含捕获序列，用于捕获目的核酸分子并作为引物延伸或逆转录；第二核酸序列包括细胞标签序列、分子标签序列和模板转换序列，细胞标签序列用于标记来源于同一细胞中的所有mRNA的分子；分子标签序列用于标记每个逆转录出来的cDNA分子，从同一支持物上的不同的RNA逆转录出来的cDNA分子都被标记上不同的分子标签；模板转换序列可以作为模板使逆转录出来的cDNA 3
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端继续延伸以标记上分子标签序列和细胞标签序列；不同种类的支持物上具有不同的细胞标签；优选地，使得支持物在芯片的微孔中捕获单细胞裂解后释放的RNA，并在逆转录过程中通过模板转换实现对来源于同一细胞的RNA标记相同的细胞标签，进一步通过TCR与BCR/Ig基因的恒定区引物实现TCR与BCR/Ig核酸序列的富集并最终打断构建为高通量单细胞VDJ测序文库。11.根据权利要求8所述的应用，其中，所述的多种核酸共标记的支持物是用于构建3
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单细胞RNA文库；其中：支持物上固定有含有细胞标签的可条件性封闭的随机引物以及RNA捕获序列，具体地，支持物上标记了至少两种核酸序列：第一核酸序列和第二核酸序列；第一核酸序列至少包含捕获序列，用于捕获目的核酸分子并作为引物延伸或逆转录；第二核酸序列包括含有细胞标签的可条件性封闭的随机引物，细胞标签序列用于标记来源于同一细胞中的所有mRNA的分子；不同种类的支持物上具有不同的细胞标签；优选地，使得支持物在芯片的微孔中捕获单细胞裂解后释放的RNA并逆转录为cDNA，随后的含有细胞标签的随机引物通过二链合成实现对来源于同一细胞的cDNA标记上相同的细胞标签，而...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦少灼，韩金桓，李研，刘书杰，马兴勇，罗云超，桑国芹，谢莹莹，徐猛，李宗文，
申请(专利权)人：北京寻因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：