用于标记核酸分子的方法和试剂盒技术

用于标记核酸分子的方法和试剂盒。本申请涉及一种处理细胞或细胞核以产生核酸片段群的方法，以及利用所述核酸片段群来生成经标记的核酸分子，构建用于转录组测序的核酸分子文库，或，对单细胞转录组进行高通量测序的方法。此外，本申请还涉及，利用所述方法构建的核酸分子文库，以及用于实施所述方法的试剂盒。以及用于实施所述方法的试剂盒。以及用于实施所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于标记核酸分子的方法和试剂盒


[0001]本申请涉及转录组测序(transcriptome sequencing)，特别是高通量单细胞转录组测序的
具体而言，本申请涉及一种处理细胞或细胞核以产生核酸片段群的方法，以及利用所述核酸片段群来生成经标记的核酸分子，构建用于转录组测序的核酸分子文库，或，对单细胞转录组进行高通量测序的方法。此外，本申请还涉及，利用所述方法构建的核酸分子文库，以及用于实施所述方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]细胞作为生物体基本的结构和功能单位，其功能和异质性研究一直是生物学领域的一大挑战。单细胞组学测序技术的发展，推进了人类对细胞多样性和异质性的认知，对发育生物学、肿瘤等疾病、辅助生殖、免疫学、神经科学、微生物等多个生物学和生物医学研究领域的发展起到了革命性的推动。单细胞测序主要包括单细胞基因组测序、转录组测序、甲基化测序、染色质可及性测序以及包含以上组学信息的单细胞多组学测序等。其本质就是通过对单个细胞内的DNA和RNA的序列、拷贝数量、修饰状态、相互作用进行分析，揭示单个细胞的基因组、转录组、甲基化、染色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种处理细胞或细胞核以产生核酸片段群的方法，其包括下述步骤：(1)提供一个或多个细胞或细胞核；(2)对所述细胞或细胞核内的RNA(例如，mRNA、非编码RNA、eRNA)进行包括逆转录步骤的处理，形成含有cDNA链的双链核酸(例如，含有RNA(例如，mRNA、非编码RNA、eRNA)链和cDNA链的杂合双链核酸)；(3)将所述双链核酸(例如，所述杂合双链核酸)与转座酶复合体孵育；其中，所述转座酶复合体含有转座酶和所述转座酶能够识别并结合的转座序列，且能够切割或断裂双链核酸(例如，含有RNA和DNA的杂合双链核酸)；并且，所述转座序列包含转移链和非转移链；其中，所述转移链包含转座酶识别序列，第一标签序列，以及，第一共有序列；其中，所述第一标签序列位于所述转座酶识别序列的上游(例如5
’
端)，且，所述第一共有序列位于所述第一标签序列的上游(例如5
’
端)；并且所述孵育在允许所述双链核酸(例如，所述杂合双链核酸)被所述转座酶复合体断裂成核酸片段且所述转移链被连接至所述核酸片段的末端(例如，所述核酸片段的5
’
端)的条件下进行；从而，形成核酸片段群；其中，所述核酸片段包含cDNA片段，以及连接至所述cDNA片段的5
’
端的转移链的序列；优选地，所述核酸片段从5
’
端至3
’
端包含第一共有序列，第一标签序列，转座酶识别序列和cDNA片段；优选地，在进行步骤(2)之前，对细胞进行透化和/或固定处理。2.权利要求1的方法，其中，在步骤(1)中提供至少2个(例如，至少10个，至少102个，至少103个，至少104个，至少105个，至少106个，至少107个，或更多个)细胞或细胞核；优选地，在进行步骤(3)之前(例如，在进行步骤(2)之前，或者在进行步骤(2)之后且在进行步骤(3)之前)，将所述细胞或细胞核分成至少2个(例如，至少3个，至少4个，至少5个，至少8个，至少10个，至少12个，至少20个，至少24个，至少50个，至少96个，至少100个，至少200个，至少384个，至少400个，或更多个)亚集，其中，每个亚集含有至少一个细胞或细胞核；优选地，在步骤(3)中，将各个亚集的细胞或细胞核内的所述双链核酸(例如，杂合双链核酸)分别与转座酶复合体孵育；优选地，对于每个亚集，所述转座酶复合体具有彼此不同的第一标签序列；由此，从各个亚集的细胞或细胞核所产生的核酸片段含有彼此不同的第一标签序列；优选地，对于每个亚集，所述转座酶复合体具有相同的转座酶，相同的转座酶识别序列，相同的第一共有序列，和/或，相同的非转移链；优选地，对于每个亚集，除了所述第一标签序列之外，所述转座酶复合体具有相同的转座酶，相同的转座酶识别序列，相同的第一共有序列，以及，相同的非转移链；优选地，各个亚集所产生的核酸片段具有相同的第一共有序列；且同一亚集所产生的核酸片段具有相同的第一标签序列；且不同亚集所产生的核酸片段具有彼此不同的第一标签序列；优选地，在进行步骤(3)之后，将至少2个亚集的细胞或细胞核合并；优选地，在进行步骤(3)之后，将至少各个亚集的细胞或细胞核合并。
3.权利要求1或2的方法，其中，所述细胞是来自动物、植物或微生物的细胞或细胞系，或其任何组合；例如，所述细胞是来自哺乳动物(例如人)的细胞或细胞系，或其任何组合；例如，所述细胞是癌细胞、干细胞、神经细胞、胎儿细胞、免疫细胞，或其任何组合；例如，所述细胞是免疫细胞，例如B细胞或T细胞；或者，所述细胞核来自免疫细胞，例如B细胞或T细胞；优选地，所述核酸片段群包含T细胞受体基因或基因产物，或B细胞受体基因或基因产物。4.权利要求1
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3任一项的方法，其中，使用逆转录酶对所述RNA(例如，mRNA、长链非编码RNA、eRNA)进行逆转录，形成含有RNA(例如，mRNA、长链非编码RNA、eRNA)链和cDNA链的杂合双链核酸；优选地，所述杂合双链核酸在cDNA链的3
’
端具有悬突；优选地，所述悬突具有至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个核苷酸的长度；优选地，所述悬突为2
‑
5个胞嘧啶核苷酸的悬突(例如CCC悬突)；优选地，所述逆转录酶具有末端转移活性；优选地，所述逆转录酶能够以RNA(例如，mRNA、长链非编码RNA、eRNA)为模板，合成cDNA链，且在所述cDNA链的3
’
端添加悬突；优选地，所述逆转录酶能够在cDNA链的3
’
末端添加长度为至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个核苷酸的悬突；优选地，所述逆转录酶能够在cDNA链的3
’
末端添加2
‑
5个胞嘧啶核苷酸的悬突(例如CCC悬突)；优选地，所述逆转录酶不具有或者具有降低的RNase活性(特别是RNase H活性)；优选地，所述逆转录酶选自，经修饰或突变以去除RNase活性(特别是RNase H活性)的M
‑
MLV逆转录酶、HIV
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1逆转录酶、AMV逆转录酶和端粒酶逆转录酶(例如，不具有RNase H活性的M
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MLV逆转录酶)；优选地，使用包含poly(T)序列的引物和/或包含随机寡核苷酸序列的引物对所述RNA(例如，mRNA、长链非编码RNA、eRNA)进行逆转录；优选地，所述poly(T)序列或所述随机寡核苷酸序列位于所述引物的3
’
端；优选地，所述poly(T)序列包含至少5个(例如，至少10个、至少15个、或至少20个)胸腺嘧啶核苷酸残基；优选地，所述随机寡核苷酸序列具有5
‑
30nt(例如，5
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10nt，10
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20nt，20
‑
30nt)的长度；优选地，所述引物不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸。5.权利要求1
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4任一项的方法，其中，所述转座酶复合体能够随机切割或断裂含有RNA和DNA的杂合双链核酸；优选地，所述转座酶选自Tn5转座酶、MuA转座酶、睡美人转座酶、Mariner转座酶、Tn7转座酶、Tn10转座酶、Ty1转座酶、Tn552转座酶，以及具有上述转座酶的转座活性的变体、修饰产物和衍生物；优选地，所述转座酶为Tn5转座酶；优选地，所述第一标签序列具有至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个或更多个核苷酸的长度；例如，所述第一标签序列的长度为4
‑
8个核苷酸；优选地，所述第一标签序列连接(例如直接连接)至所述转座酶识别序列的5
’
端；优选地，所述第一共有序列具有至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10
个，至少12个，至少15个，至少18个，至少20个，至少25个或更多个核苷酸的长度；例如，所述第一共有序列的长度为12
‑
25个核苷酸；优选地，所述第一共有序列连接(例如直接连接)至所述第一标签序列的5
’
端；优选地，所述转移链从5
’
端至3
’
端包含第一共有序列，第一标签序列，和转座酶识别序列；优选地，所述转座酶识别序列具有如SEQ ID NO:99所示的序列；优选地，所述非转移链能够与所述转移链退火或杂交形成双链体；优选地，所述非转移链包含与转移链中的转座酶识别序列互补的序列；优选地，所述非转移链具有如SEQ ID NO:1所示的序列；优选地，所述转移链不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸；和/或，所述非转移链不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸；优选地，所述非转移链的5
’
末端具有磷酸基团修饰；和/或，所述非转移链的3
’
末端是封闭的(例如，所述非转移链的3
’
末端核苷酸为双脱氧的核苷酸)。6.权利要求1
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5任一项的方法，其中，在步骤(3)中，在所述细胞或细胞核内形成所述核酸片段群；优选地，所述核酸片段群用于构建转录组文库(例如，5
’
端转录组文库)或用于转录组测序(例如，5
’
端转录组测序)；优选地，所述核酸片段群用于构建靶核酸(例如，V(D)J序列)的文库或用于靶核酸(例如，V(D)J序列)的测序。7.一种生成经标记的核酸分子的方法，其包括下述步骤：(a)提供：一个或多个细胞或细胞核，所述细胞或细胞核是根据权利要求1
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6任一项所述的方法进行了处理的细胞或细胞核，其含有核酸片段群；和一个或多个偶联寡核苷酸分子的珠粒，所述寡核苷酸分子含有标记序列；和(b)使用所述核酸片段和所述寡核苷酸分子生成经标记的核酸分子，所述经标记的核酸分子从5'末端到3'末端包含所述核酸片段的序列以及所述标记序列的互补序列，或者包含所述标记序列以及所述核酸片段的互补序列。8.权利要求7的方法，其中，在步骤(a)中，提供至少2个(例如，至少10个，至少102个，至少103个，至少104个，至少105个，至少106个，至少107个，或更多个)细胞或细胞核；和/或，提供至少2个(例如，至少10个，至少102个，至少103个，至少104个，至少105个，至少106个，至少107个，至少108个，或更多个)珠粒；优选地，在步骤(a)中，在微孔或液滴中(例如，在多个微孔或液滴中)提供所述细胞或细胞核，以及所述珠粒；优选地，所述液滴是油包水液滴。9.权利要求7或8的方法，其中，所述珠粒偶联了多个(例如，至少10个，至少102个，至少103个，至少104个，至少105个，至少106个，至少107个，至少108个，或更多个)寡核苷酸分子；优选地，所述寡核苷酸分子偶联至珠粒的表面，和/或，封闭在珠粒内；优选地，所述珠粒能够自发地或在暴露于一种或多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)时释放所述寡核苷酸；优选地，所述珠粒是凝胶珠粒。
10.权利要求7
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9任一项的方法，其中，所述标记序列包含选自下列的元件：第一扩增引物序列，第二共有序列，第二标签序列，独特分子标签序列，模板转换序列，或其任何组合；优选地，所述标记序列包含第二共有序列，第二标签序列，独特分子标签序列和模板转换序列；优选地，所述标记序列还包含第一扩增引物序列；优选地，所述模板转换序列包含与所述cDNA链的3
’
末端悬突互补的序列；优选地，所述悬突为2
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5个胞嘧啶核苷酸的悬突(例如CCC悬突)，且所述模板转换序列的3
’
末端包含2
‑
5个鸟嘌呤核苷酸突(例如GGG)；优选地，所述模板转换序列具有至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或更多个核苷酸的长度；优选地，所述模板转换序列不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸(例如锁核酸)；优选地，所述独特分子标签序列具有至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或更多个核苷酸的长度；优选地，所述独特分子标签序列不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸；优选地，所述第二标签序列具有至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或更多个核苷酸的长度；优选地，所述第二标签序列不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸；优选地，所述第二共有序列具有至少3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个或更多个核苷酸的长度；优选地，所述第二共有序列不包含修饰，或者包含修饰的核苷酸；优选地，所述珠粒偶联了多个寡核苷酸分子，并且，各个寡核苷酸分子具有彼此不同的独特分子标签序列；优选地，各个寡核苷酸分子具有相同的第二标签序列和/或相同的第二共有序列；优选地，所述方法使用了多个珠粒，并且，每个珠粒各自具有多个寡核苷酸分子；并且，同一个珠粒上的所述多个寡核苷酸分子具有相同的第二标签序列，并且，不同珠粒上的寡核苷酸分子具有彼此不同的第二标签序列；优选地，各个珠粒上的寡核苷酸分子具有相同的第二共有序列；优选地，各个珠粒上的寡核苷酸分子还具有相同的第一扩增引物序列；优选地，所述模板转换序列位于所述标记序列的3
’
末端；优选地，所述第二共有序列位于所述第二标签序列，独特分子标签序列和/或模板转换序列的上游；优选地，所述第一扩增引物序列位于所述第二共有序列的上游；优选地，所述标记序列从5
’
端至3
’
端包含任选的第一扩增引物序列，第二共有序列，第二标签序列，独特分子标签序列和模板转换序列。11.权利要求7
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10任一项的方法，其中，在步骤(b)中，通过选自下列的方式，使所述核酸片段和所述寡核苷酸分子接触：(b1)将细胞或细胞核裂解以释放核酸片段；(b2)将寡核苷酸分子从珠粒上释放；或者(b3)(b1)和(b2)的组合；优选地，在步骤(b)中，所述寡核苷酸分子通过模板转换序列与含有cDNA链的3
’
末端悬突的核酸片段退火或杂交，其中，所述模板转换序列包含与所述cDNA链的3
’
末端悬突互补的序列；并且，在核酸聚合酶(例如，DNA聚合酶或逆转录酶)的作用下，所述核酸片段以所述
寡核苷酸分子为模板被延伸，或所述寡核苷酸分子以所述核酸片段为模板被延伸，从而生成经标记的核酸分子；优选地，步骤(b)中使用的核酸聚合酶与步骤(2)中使用的逆转录酶是相同的；优选地，所述经标记的核酸分子从5'末端到3'末端包含所述核酸片段的序列以及所述标记序列的互补序列，其中所述核酸片段包含与RNA(例如，mRNA、非编码RNA、eRNA)的5
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端序列互补的序列；优选地，所述经标记的核酸分子从5'末端到3'末端包含第一共有序列，第一标签序列，转座酶识别序列，cDNA片段的序列，模板转换序列的互补序列，独特分子标签序列的互补序列，第二标签序列的互补序列，第二共有序列的互补序列，以及任选的第一扩增引物序列的互补序列；优选地，所述cDNA片段包含与RNA(例如，mRNA、长链非编码RNA、eRNA)的5
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端序列互补的序列；优选地，所述方法还包括：(c)回收和纯化所述经标记的核酸分子；优选地，所述经标记的核酸分子用于构建转录组文库(例如，5
’
端转录组文库)或用于转录组测序(例如，5
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端转录组测序)；优选地，所述核酸片段群用于构建靶核酸(例如，V(D)J序列)的文库或用于靶核酸(例如，V(D)J序列)的测序。12.一种构建核酸分子文库的方法，其包括，(i)根据权利要求7
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11任一项的方法生成多个经标记的核酸分子，以及，(ii)回收和/或合并多个经标记的核酸分子，从而获得核酸分子文库；优选地，在步骤(ii)中，回收和/或合并由多个珠粒衍生的经标记的核酸分子。13.权利要求12的方法，其中，所述方法还包括，(iii)富集所述经标记的核酸分子；优选地，在步骤(iii)中，对所述经标记的核酸分子进行核酸扩增反...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋岚，李芸，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所国家生物信息中心，
类型：发明
国别省市：