扩增基因组DNA的方法、试剂盒及其获得扩增引物的方法技术

本申请提供扩增基因组DNA的方法、试剂盒及获得简并碱基序列的方法，第一反应混合物包括：样本基因组DNA、第一引物和核酸聚合酶，第一引物从5

【技术实现步骤摘要】
扩增基因组DNA的方法、试剂盒及其获得扩增引物的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及扩增单细胞全基因组DNA的方法、试剂盒以及获得扩增引物的方法。

技术介绍

[0002]细胞是生命体的基本单位。随着分子生物学技术的迅猛发展，单个细胞包含的核酸信息日益成为研究及临床应用热点，主要原因有：(1)样本宝贵或样本起始量低，如人类的卵细胞，生殖细胞，肿瘤循环细胞等。(2)来源于同一样本的不同单细胞基因组存在异质性，如肿瘤组织。因此需要获得该组织不同部位的单细胞基因组信息，而非整个组织的基因组信息。(3)当前的核酸检测技术如新一代测序(NGS，Next Generation Sequencing)、基因芯片(Microarray)、荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)等均对待分析样本的起始量有较高的要求(100ng以上DNA)。因此，对于单个细胞(6pg左右DNA)或者少量起始量的样本，需要对单细胞的全基因组扩增从而获得足量用于分析的核酸物质。
[0003]目前在市面上或已发表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩增基因组DNA的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)提供第一反应混合物，所述第一反应混合物包括：样本基因组DNA、第一引物和核酸聚合酶，所述第一引物从5
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端到3
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端包括：通用序列和简并碱基序列，所述简并碱基序列从5
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端到3
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端为2N+4N+HGCH所述N和H为简并子集合，G和C为碱基，其中，N＝{A、T、C、G},H＝{A、T、C}；(b)将所述第一反应混合物置于第一温度循环程序进行预扩增，获得预扩增产物；(c)提供第二反应混合物，所述第二反应混合物包括：步骤(b)中获得的预扩增产物、第二引物、第三引物和核酸聚合酶，所述第二引物是文库构建中的通用引物接头，所述第三引物是文库构建中的index引物接头；(d)将所述第二反应混合物置于第二温度循环程序进行扩增，获得扩增产物。2.如权利要求1所述的扩增基因组DNA的方法，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：(1)所述简并碱基序列从5
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端到3
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端为2N+4K+HGCH、2N+4M+HGCH、2N+4Y+HGCH或2N+4R+HGCH中的一种或多种，所述K、M、Y和R为简并子集合，其中，K＝{T、G},M＝{A、C},Y＝{C、T},R＝{A、G}；(2)所述简并碱基序列为在人类基因组DNA上分布均匀且间隔较短的识别位点或识别位点组合获得的权重值高的简并碱基设计的，所述简并碱基序列在扩增中的能够尽可能多的识别整个人基因组中的特定长度间隔的碱基组成，并与之结合启动核酸扩增反应，能够在保证基因组覆盖度的同时，在测序过程中文库的插入片段大小相匹配。3.如权利要求2所述的扩增基因组DNA的方法，其特征在于，所述简并碱基序列的获得，包括步骤：(S1)采集人类基因组DNA的内切酶及其识别位点，统计并筛选出在人类基因组DNA上分布均匀且间隔较短的内切酶或内切酶组合及其识别位点或识别位点组合；(S2)将步骤S1中筛选出的内切酶或内切酶组合及其识别位点或识别位点组合进行汇总分析，筛选出权重值高的简并碱基来设计简并碱基序列，所述简并碱基序列为10bp，从而实现对人类基因组DNA的定点有效扩增。4.如权利要求3所述的扩增基因组DNA的方法，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：(1)在步骤S1中，使用R程序语言程序包计算输入的内切酶识别位点,统计不同识别位点在人类基因组的分布、数量以及相邻识别位点间碱基的长度，筛选出在人类基因组DNA上分布均匀且间隔较短的、并且在人类基因组所有染色体均有分布的识别位点或识别位点组合，不同识别位点之间的碱基长度为40
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300bp，识别位点或识别位点组合在每条染色体上的分布密度≥50个/1Mb，该识别位点或识别位点组合在整个基因组的覆盖度和不同基因功能区域的覆盖度均较高；(2)在步骤S2中，获得第一引物中3
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端的前4个碱基为在相应碱基位置上的权重高的简并碱基，所述第一引物中5
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端的6个碱基为通过碱基平衡策略获得的简并碱基。5.如权利要求1所述的扩增基因组DNA的方法，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：(1)所述通用序列用于在预扩增产物的两端添加一段能够被第二引物和第三引物所识
Taq DNA聚合酶、HotStart Taq DNA聚合酶、Ampl iTaq Gold DNA聚合酶、Pyrobest
TM
DNA聚合酶、Taq Plus DNA聚合酶、PrimerSTAR HSDNA聚合酶、DNA聚合酶中的一个或多个；(3)所述热裂解的细胞裂解剂包括：蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、Protease、DTT、NP
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40、吐温、SDS、TritonX
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100、TrisHcl、EDTA、异硫氰酸胍中的一个或多个；(4)所述第一温度循环程序包括：(b1)在90℃
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98℃的温度之间变性1
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10mins，将所述DNA双链打开，能够保证在打开DNA双链的同时，最大限度的减少长时间高温对DNA完整性的破坏；(b2)在3
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50℃温度间设置不同的温度梯度以利于第一引物与DNA模板结合，所述温度梯度包括：10
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15℃间特定温度、20
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25℃间特定温度、30
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35℃间特定温度、40
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45℃间特定温度、50
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55℃间特定温度；(b3)升温使与DNA模板结合的第一引物在DNA聚合酶的帮助下，以dNTP为原料向前延伸，延伸温度为50
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90℃，延伸时间为1
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15mins(考虑到聚合酶的延伸长度，延伸速率及错配率)；(b4)升温使步骤b3中产生的延伸产物从DNA模板上脱落下来,脱落温度为90℃
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98℃，时间为10
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50sec；(b5)重复步骤b2至b4，获得最大产量的预扩增产物；(5)所述第二温度循环程序包括：(d1)在90℃
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98℃的温度之间变性1
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10mins，将所述DNA双链打开；(d2)升温使与DNA模板结合的第二引物和第三引物在DNA聚合酶的帮助下，以dNTP为原料向前延伸，延伸温度为50
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90℃，延伸时间为1
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15mins；(d3)升温使步骤d2中产生的延伸产物从DNA模板上脱落下来，脱落温度为90℃
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98℃，时间为10
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50sec；(d4)重复步骤d2至d4，获得最大产量的扩增产物。7.一种用于扩增基因组DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：第一引物、第二引物、第三引物和核酸聚合酶，所述第一引物从5
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端到3
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端包括：通用序列和简并碱基序列，所述简并碱基序列从5
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端到3
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端为2N+4N+HGCH，所述N和H为简并子集合，G和C为碱基，其中，N＝{A、T、C、G},H＝{A、T、C}；所述第二引物是文库构建中的通用引物接头，所述第三引物是文库构建中的index引物接头。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括选自下组的一个或多个特征：(1)所...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶艳艳，丁庆宇，
申请(专利权)人：江苏海伯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：