本发明专利技术公开了一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法及扩增引物。该扩增引物包括引物对1和引物对2；引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和4所示。本发明专利技术只需两对扩增引物，通过一次PCR扩增，即可获得足量的线粒体DNA样本，大大减少了繁杂的引物量和成本的投入，并简化操作。本发明专利技术通过两对引物的扩增产物混合建库，提高了mtDNA的完整性和准确性，保证数据分析的有效性。保证数据分析的有效性。保证数据分析的有效性。
【技术实现步骤摘要】
NO.2所示，所述引物对2的上游引物MT2
‑
F如SEQ ID NO.3所示，下游引物MT2
‑
R如SEQ ID NO.4所示。
[0008]本专利技术还提供了一种用于构建线粒体基因组测序文库的试剂盒，其包括所述的人线粒体扩增引物。
[0009]本专利技术另一方面提供了一种人线粒体基因组扩增方法，其包括如下步骤：
[0010]以全血DNA为模板，采用所述的人线粒体扩增引物进行PCR扩增。
[0011]优选地，所述PCR扩增的PCR反应体系包括：5
×
PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，PrimeSTAR GXL DNAPolymerase 1μL，模板DNA 1μL，10μM MT1
‑
F/MT2
‑
F 1μL，10μM MT1
‑
R/MT2
‑
R 1μL，NF
·
H2O32μL。
[0012]优选地，所述PCR扩增的PCR反应程序为：预变性98℃2min；98℃变性10s，68℃退火/延伸10min，进行32个循环；68℃延长15min；然后4℃保存。
[0013]本专利技术还提供了一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法，其包括如下步骤：
[0014]1)以全血DNA为模板，采用所述的人线粒体基因组扩增方法进行PCR扩增；
[0015]2)将两对引物扩增所得的mtDNA等量混匀，进行文库构建。
[0016]优选地，所述的步骤2)包括：
[0017]2.1)将两对引物扩增所得的mtDNA等量混匀，用超声打断仪进行片段化；
[0018]2.2)将片段化产物进行修复以及末端加单碱基A；
[0019]2.3)进行接头连接反应；
[0020]2.4)进行磁珠纯化和片段筛选，质控检测完成文库构建。
[0021]作为本专利技术的优选方案，所述的步骤2.1)：分别取同一样本的MT1产物和MT2产物各500ng，混匀后加Nuclease
‑
free ddH2O补足体积至55μL，用超声打断仪进行片段化，打断时间为80s。
[0022]本专利技术还进一步提供了一种用于构建线粒体基因组测序文库的试剂盒，其包括上述的人线粒体扩增引物。本专利技术的有益效果包括：
[0023](1)通过简单的两对引物PCR扩增，即可获得完整足量的mtDNA样本，无需繁杂的引物组合配对使用，简化人员操作，经济快速；
[0024](2)通过两对引物的扩增产物混合建库，提高了mtDNA的完整性和准确性，保证数据分析的有效性。
附图说明
[0025]图1是引物对MT1和MT2的位置及其扩增方向示意图；
[0026]图2是引物对MT1和MT2扩增产物凝胶电泳鉴定图。
[0027]图3是线粒体测序数据覆盖度。
具体实施方式
[0028]下面将结合具体的实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，但本专利技术不仅限于以下实施例。
[0029]取4例样本，进行样本专利技术的验证，实施流程具体步骤如下：
[0030]1、mtDNA模板的提取与保存
[0031]将采集的外周静脉血按常规全血DNA提取流程进行DNA提取。
[0032]2、引物对设计
[0033]采用PrimerPremier 5设计线粒体扩增引物引物对1和引物对2，引物序列如表1所示。
[0034]表1.mtDNA扩增引物
[0035]编号引物序列SEQ ID NO.1MT1
‑
FGGTAAAGGTCGGTTTATCSEQ ID NO.2MT1
‑
RTATGCCTCTTCACGSEQ ID NO.3MT2
‑
FCGATACTCGGACACCCSEQ ID NO.4MT2
‑
RAGGGGCGTTTGGTATGG
[0036]3、分别使用两对扩增引物，以全血DNA为模板，扩增mtDNA，冰上配置PCR反应体系如下：
[0037][0038]PCR反应条件：
[0039][0040]将MT1扩增产物和MT2扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示如图2所示。使用Qubit测定产物浓度。
[0041]4、线粒体DNA文库构建
[0042]分别取同一样本的MT1产物和MT2产物各500ng，混匀后加Nuclease
‑
free ddH2O补足体积至55μL，用超声打断仪进行片段化，打断时间为80s。
[0043]随后，配置如下反应体系：
[0044]组分体积/用量
打断产物50μLEnd Prep Mix415μLTotal65μL
[0045]反应程序如下：
[0046]步骤温度1105℃220℃365℃44℃
[0047]该反应对打断产物进行修复以及末端加A，随后进行接头连接反应，反应体系如下：
[0048]组分体积修复产物65μLRapid Ligation Buffer325μLRapid DNA Ligase5μLDNAAdapter X5μLTotal100μL
[0049]将混合物置于PCR仪中，反应条件为20℃，15min。
[0050]5.磁珠纯化和片段筛选
[0051]吸取60μL VAHTS DNA Clean Beads至100μL接头连接产物中，涡旋震荡混匀。
[0052]室温孵育5min。
[0053]将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)小心移除上清。
[0054]保持PCR管始终置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30s后小心移除上清。
[0055]重复漂洗一次，总计漂洗两次。
[0056]保持PCR管始终置于磁力架上，开盖空气干燥磁珠5
‑
10min至无乙醇残留。
[0057]加入105μL Nuclease
‑
free water，涡旋震荡于室温放置2min。
[0058]将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后(约5min)小心移取100μL上清至新的EP管中。
[0059]吸取59μL VAHTS DNA Clean Beads至100μL产物中，涡旋震荡充分混匀。
[0060]室温孵育5min。
[0061]将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后(约5min)小心转移上清至新PCR管中，丢弃磁珠。
[0062]吸取15μL VAHTS DNA CLean Beads磁珠至上清中，涡旋震荡。
[0063]室温孵育5min。
[0064]将PCR管短暂离心并置于磁本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人线粒体扩增引物，其特征在于，包括引物对1和引物对2；所述引物对1的上游引物MT1
‑
F如SEQ ID NO.1所示，下游引物MT1
‑
R如SEQ ID NO.2所示，所述引物对2的上游引物MT2
‑
F如SEQ ID NO.3所示，下游引物MT2
‑
R如SEQ ID NO.4所示。2.一种人线粒体基因组扩增方法，其特征在于包括如下步骤：以全血DNA为模板，采用权利要求1所述的人线粒体扩增引物进行PCR扩增。3.根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增的PCR反应体系包括：5
×
PrimeSTAR GXL Buffer 10μL，dNTP Mixture(2.5mM each)4μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL，模板DNA 1μL，10μM MT1
‑
F/MT2
‑
F 1μL，10μM MT1
‑
R/MT2
‑
R 1μL，NF
·
H2O 32μL。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：雷继海，华大颂，肖锐，
申请(专利权)人：杭州博圣医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。