本发明专利技术公开了一种不对称PCR联用磁敏检测器检测目标基因或目标基因的SNP位点的方法及其装置。所述不对称PCR联用磁敏检测器检测基因标志物的方法包括以下步骤：(1)提供生物样本并对其进行处理；(2)通过不对称PCR扩增获得带生物素标记的单链基因标志物；(3)对单链基因标志物进行杂交，并与经修饰的磁珠结合；(4)通过磁敏检测器检测信号。本发明专利技术提供的方法可以直接从血液中扩增目标基因，无需专门的DNA提取纯化，能缩短从血液获得目标基因的反应时间。本发明专利技术提供的不对称PCR体系可实现同时扩增、检测多个目标基因，且目标基因为带标记物的单链DNA、降低了互补链对捕获探针杂交反应的影响，所述单链DNA易与捕获探针杂交结合，提高输出信号的强度。高输出信号的强度。高输出信号的强度。
【技术实现步骤摘要】
不对称PCR联用磁敏检测器检测目标基因或目标基因的SNP位点的方法及其装置
[0001]本专利技术属于核酸扩增
，具体涉及不对称PCR联用磁敏检测器检测目标基因或目标基因的SNP位点的方法及其装置。
技术介绍
[0002]从血液到目标基因序列扩增，通常需要血液DNA提取纯化和PCR扩增两个步骤。特别地，DNA提取纯化需要复杂的多种溶液输送存储体系，且提取纯化过程耗时较长。另外，PCR扩增所得的目标基因产物一般为双链结构，不能直接与芯片上的捕获探针杂交结合；但将双链变性后与芯片上的捕获探针杂交，双链中的互补链复性会影响捕获探针与目标基因单链的杂交结合，导致输出信号低。
[0003]单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每300个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起。通常所说的SNP都是二等位多态性的。
[0004]细胞色素P450超家族(Cytochrome P450 proteins,CYP)是人体内代谢药物的一种重要的酶，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的(包括大多数临床药物)代谢。CYP有多个亚家族，其中CYP2C9(Cytochrome P450 2C9)是第二亚家族中的一个重要成员，占肝微粒体P450蛋白总量的20％。CYP2C9能羟化代谢许多不同性质的药物，主要是酸性底物。据统计，约有16％的临床药物由CYP2C9负责代谢。近年来，很多CYP2C9的多态性位点被不断发现，表明CYP2C9具有高度的遗传多态性。CYP2C19也是细胞色素P450超家族第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢酶，CYP2C19也具有很多SNP位点。
[0005]不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。不对称PCR与普通PCR的差异主要是使用的正向引物、反向引物的量不相同，一般正向引物和反向引物的比例是20：1～100:1。在扩增过程前10-20个循环，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物(反向引物或低浓度引物)消耗殆尽，不再引导扩增，而非限制性引物(正向引物或高浓度引物)引导的PCR会继续进行，从而产生了大量的单链DNA(ssDNA)。多重PCR是在同一个PCR反应体系里加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与普通PCR相同。
[0006]GMR磁敏检测器主要由GMR传感器和信号检测电路组成。其检测对象是含有免疫磁珠标记的生物样品。不同的生物样品量的不同导致不同量的磁珠固定在传感器表面；在施加的外部激励磁场的作用下免疫磁珠产生附加磁场，磁珠产生的附加磁场会使GMR传感器输出信号发生变化，从而实现对生物样品的探测。信号检测电路会使十分微弱的GMR传感器
信号通过放大得到检测。
技术实现思路
[0007]专利技术要解决的问题
[0008]鉴于现有技术中的这些问题，为了缩短检测流程、提高信号输出值。本专利技术对生物样本直接进行PCR扩增，得到所需的目标基因。无需专门设计DNA提取纯化体系缩短反应时间。
[0009]用于解决问题的方案
[0010]本专利技术是关于一种将血液及其他样本直接进行细胞裂解，然后通过多重不对称PCR扩增直接获得多种带标记的单链基因标志物；单链基因标志物通过杂交被捕获探针固定，然后标记物结合磁珠，输出磁信号的技术。本专利技术将DNA提取及PCR扩增合并于一个反应中，能缩短系统检测时间和简化试剂卡片的设计，便于基因的即时检测。
[0011]本专利技术的多重不对称PCR扩增体系中包含多对引物，其中通过将上游引物和下游引物保持不同的量来实现同时扩增多个目标基因，而且得到的目标基因产物为单链目标基因。特别地，对上游引物的5
’
端进行生物素(biotin)修饰，使得到的单链目标基因能与相应的链霉亲和素(Streptavidin，简称SA)修饰的磁珠形成“Biotin-SA”结合，输出信号；或者，对上游引物的5
’
端进行硫代修饰，使得到的单链目标基因能与相应的包被金颗粒的磁珠形成“金-S”结合，输出信号。
[0012]本专利技术的多重不对称PCR通过抗抑制剂的Taq DNA聚合酶，以裂解液处理的血细胞释放出来的DNA为模板，将多对不等量的上、下游引物和dNTP等集中在一个反应槽，通过温度控制实现直接PCR。其中，所述裂解液的体积为50μL，其组成为：10～15mM Tris-HCl pH 8.0、15～20mM NaCl、5～15mM EDTA pH 8.0、0.4～1％(w/v)SDS和0.5～1％(v/v)TWEEN 20；其组成优选为：10mM Tris-HCl pH 8.0、15mM NaCl、10mM EDTA pH8.0、0.4％(w/v)SDS和0.5％(v/v)TWEEN 20。
[0013]本专利技术的多重不对称PCR，通过多对上、下游引物对人体基因进行PCR扩增。特别地，所需目标基因单链由上游引物延伸所得，上游引物的添加量远多于下游引物的添加量，使得PCR产物为单链DNA。对上游引物的5
’
端进行标记修饰，保证单链DNA与捕获探针杂交结合的同时能通过标记与磁珠结合，输出信号。
[0014]本专利技术提供的检测方法包括：“从血液到目标基因”(即预处理)的过程，和“目标基因在芯片表面被捕获、结合磁珠，进行信号输出”(即检测和诊断)的过程(具体参见图1)。
[0015]本专利技术所述“从血液到目标基因”的过程仅需在试剂卡片设置一个反应槽，将血液与细胞裂解液、抗抑制剂Taq DNA聚合酶、多个上游标记引物和下游引物、dNTP混合即可进行PCR反应。具体的包括：细胞裂解液裂解细胞释放DNA；以DNA为模板，在Taq DNA聚合酶酶、带标记的上游引物、下游引物和dNTP的作用下，扩增出带标记的目标基因单链DNA。
[0016]本专利技术所述“目标基因在芯片表面被捕获、结合磁珠，进行信号输出”的过程包括：芯片上包被的捕获探针与目标基因单链DNA杂交，目标基因标记与相应修饰的磁珠结合，通过磁珠的结合量来对目标基因进行定量。
[0017]具体来说，本专利技术如下所述：
[0018]本专利技术的第一方面，提供了一种不对称PCR联用磁敏检测器检测目标基因或目标
基因的SNP位点的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0019](1)提供生物样本并对其进行预处理；
[0020](2)通过不对称PCR扩增获得带生物素标记的单链基因标志物；
[0021](3)对单链本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种不对称PCR联用磁敏检测器检测目标基因或目标基因的SNP位点的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)提供生物样本并对其进行预处理；(2)通过不对称PCR扩增获得带生物素标记的单链基因标志物；(3)对单链基因标志物进行杂交，并与经修饰的磁珠结合；(4)通过磁敏检测器检测信号。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作如下：将生物样本与裂解液进行混合，释放生物样本中的DNA，作为步骤(2)中不对称PCR扩增的模板；优选的，所述生物样本为血液，所述裂解液的组成为：10～15mM pH＝8.0的Tris-HCl、15～20mM NaCl、5～15mM pH＝8.0的EDTA、0.4～1％(w/v)SDS、0.5～1％(v/v)TWEEN 20。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)的具体操作如下：将步骤(1)中经过预处理的生物样本、Taq DNA聚合酶、包含MgCl2和dNTP的PCR缓冲液、带有标记物的上游引物、下游引物、EDTA和ddH2O混合，进行不对称PCR扩增；优选的，所述上游引物中带有的标记物为生物素，所述Taq DNA聚合酶为Phusion Blood II DNA聚合酶，所述PCR缓冲液中MgCl2和dNTP的浓度分别为2～4mM和0.1～0.3mM。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的浓度比为50:1～100:1；优选的，所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的浓度比为50:1。5.根据权利要求1所述的方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：周飞，付瑜，李炳辉，许思瑶，
申请(专利权)人：TDK株式会社，
类型：发明
国别省市：
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