一种FFPE样本RNA文库及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种FFPE样本RNA融合突变文库的构建方法。该方法在建库过程中，加入一段人造序列(质粒)与用于检测RNA fusion突变的引物池panel一起进行有效扩增和建库，保证出库量的同时，由于质粒的优势扩增，降低了panel引物的非特异碰撞、结合和扩增的概率，降低了引物和接头二聚体的产生，该方法高效，方便，适于推广应用。适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种FFPE样本RNA文库及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种FFPE样本RNA文库及其构建方法。

技术介绍

[0002]离体的肿瘤组织容易丧失原有正常的结构和功能，而使用福尔马林固定石蜡包埋处理的样本(Formalin
‑
Fixed andParrffin
‑
Embedded，FFPE)可以在常温保留很久，所以对肿瘤组织进行石蜡包埋保存就成了医院里最常用的样本储存手段。福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响，从石蜡切片中提取高质量核酸，并构建出信息完整、可用于后续RNA研究的文库，是相当的难题。
[0003]RNAFFPE样本的复杂性：1.会与蛋白质和其他细胞成分交联；2.随着时间的推移可导致福尔马林氧化成甲酸，从而引起碱基脱嘌呤和核酸链断裂，造成提取量和RNA质量偏低；3.易受到PCR抑制剂的污染，样本中含有PCR抑制剂。其复杂性导致了基于扩增子方法学建库测序的RNA文库构建困难，出库量较低，因而建库成功率低；引物和接头二聚体较严重，因而文库质量差。
[0004]IlluminaMiniseq和Miseq测序平台对上机文库变性有最低要求为2nM，低于2nM变性效果差，测序成功率低；因此规定了可用于上机文库测序的文库需要具有一定的出库浓度(例如本专利所涉及的panel要求RNA文库出库浓度≥0.4ng/μl)；另外，由于RNA样本的复杂性，低质量的FFPE RNA样本建库过程中容易引入过高的引物二聚体和接头二聚体。因此，在临床应用中，常规扩增子建库方法文库质量低，建库成功率低。为了解决扩增子文库质量(提高文库目的片段比例，降低引物和接头二聚体等非主峰片段比例)和RNA建库成功率低(RNA出库浓度较低)的问题，科技工作者提出了诸如增加扩增循环数，提高测序深度等方法。
[0005]现有技术的缺陷和不足：
[0006]1、增加扩增循环数，可提高RNA建库成功率，但低质量的FFPE RNA样本建库过程中容易引入过高的引物二聚体(dimer)和接头二聚体，过高的接头二聚体会造成采用qubit定量的方法文库主峰定量的不准确，影响文库的准确pooling。
[0007]2、增加测序深度，直接提高了单样本检测成本，造成不必要的浪费，并且质量差的FFPE样本由于出库浓度低并不能进行illumina平台的测序。

技术实现思路

[0008]有鉴于此，本专利技术提供了一种FFPE样本RNA文库的构建方法。该方法在建库过程中，加入一段人造序列(SEQ ID NO：1所示的DNA片段)与混有质粒上下游引物的可用于检测RNA fusion突变的引物池panel一起进行有效扩增和建库，提高了建库成功率和RNA扩增子文库质量。
[0009]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]本专利技术提供一种FFPE样本RNA文库的构建方法，包括如下步骤：
[0011]步骤1：提取FFPE样本的RNA，经反转录获得cDNA产物；
[0012]步骤2：向所述cDNA产物的扩增体系中加入含SEQ ID NO：1所示DNA片段的质粒和用于扩增SEQ ID NO：1所示DNA片段的引物；按照RNA测序文库的构建方法构建文库。
[0013]本专利技术在建库过程中掺入一段DNA片段人造序列，即包含SEQ ID NO：1所示片段的质粒，与混有SEQ ID NO：2～3上下游引物的可用于检测RNA fusion突变的引物池panel一起进行有效扩增和建库。该DNA片段与人类基因组没有同源序列，可以是人工合成，也可以以spikein
‑
09质粒为模板由SEQ ID NO：2～3所示的引物扩增获得。各序列如下：
[0014]SEQ ID No.1：
[0015]TGTGAACTGTCATCGGTCCGATCAATTAGTCTAGTGTGCGTTATTCAGATCGAGTGAGTACATGATTCGTCAGTGTGGATCAATTACAGTTAGGCCGCTGACACATTAGTAACGTCGGCAAGCACTTAGTCGTGTCGTAAGCCAGTGTGTCGTGTCT。
[0016]上游引物1：
[0017]5’‑
CCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGTGAACTGTCATCGGTCCG
‑3’
[0018](SEQ ID No.2)；
[0019]下游引物2：
[0020]5’‑
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGAAAGACACGACACACTGGCTT
‑3’
(SEQ ID No.3)。
[0021]其中，所述上下游引物中5
’
端下划线标记的序列为tail序列，这部分序列可以与本专利技术第二轮PCR中的index引物序列结合，形成完整的接头，用于完成测序。
[0022]一些实施方案中，DNA产物的扩增体系，掺入的spikein
‑
09质粒的拷贝数为4.5
×
10^5。
[0023]步骤1中，在所述反转录之前还包括对RNA进行预处理的步骤；所述预处理为：将所述RNA与反转录混合液混合，65℃反应5min，获得预处理反应产物。
[0024]一些实施方案中，步骤2中，所述RNA测序文库的构建方法包括：对所述加入SEQ ID NO：1所示DNA片段的扩增体系进行第一轮PCR扩增，经纯化、消化后，回收消化产物进行第二轮PCR扩增，纯化，获得FFPE样本RNA文库。
[0025]一些实施方案中，步骤2中，所述第一轮PCR扩增的扩增体系包括：
[0026]1μl spikein质粒、4μl扩增混合液1，5nM～10nM检测RNA fusion突变的引物池，5nM～10nM SEQ ID NO：2～3所示的引物，10μl～30cDNA产物，无核酸酶水补足至20μl。
[0027]一些实施方案中，所述扩增混合液1包括DNA聚合酶、缓冲液、镁离子和dNTP。
[0028]一些实施方案中，所述上、下游引物的比例为1：1～2：1。一些具体实施例中，上、下游引物的比例为1:1。
[0029]以上扩增体系中，各组分的浓度均为工作浓度。
[0030]第一轮PCR扩增的程序为：预变性95℃10min，变性98℃15s，退火/延伸60℃5min，保存10℃∞；变性、退火/延伸为10个循环。
[0031]本专利技术步骤2中，采用磁珠对第一轮PCR扩增产物和第二PCR扩增产物进行纯化，然后用TE buffer洗脱。
[0032]一些实施方案中，所述消化体系包括：
[0033]消化缓冲液2μl，消化反应液1μl，第一轮PCR扩增后的纯化产物10μl，无核酸酶水7
μl。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种FFPE样本RNA文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：提取FFPE样本的RNA，经反转录获得cDNA产物；步骤2：向所述cDNA产物的扩增体系中加入含SEQ ID NO：1所示DNA片段的质粒和用于扩增SEQ ID NO：1所示DNA片段的引物；按照RNA测序文库的构建方法构建文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，在所述反转录之前还包括对RNA进行预处理的步骤；所述预处理为：将所述RNA与反转录混合液混合，65℃反应5min，获得预处理反应产物。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述RNA测序文库的构建方法包括：对所述加入SEQ ID NO：1所示DNA片段的扩增体系进行第一轮PCR扩增，经纯化、消化后，回收消化产物进行第二轮PCR扩增，纯化，获得FFPE样本RNA文库。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述包含SEQ ID NO：1所示的DNA片段的质粒为spikein质粒，所述扩增SEQ ID NO：1所示的DNA片段的引物包括：SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物。5.根据权利要求1～4任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述第一轮PCR扩增的扩增体系包括：1μl spikein质粒、4μl扩增混合液1，5nM～10nM检测RNAfusion突变的引物池，5nM～10nM SEQ ID NO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤明，魏丽，许青，杜波，
申请(专利权)人：武汉臻和医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：