一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物以及鉴定方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物以及鉴定方法。所述引物序列为YL_F：AACACCCAGAGCTGTTCGAC；和YL_R：CAAGCCCTTTGTAGACCATCTA。所述鉴定方法包括利用上述PCR引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，结果无特异性条带的为雄性，有810bp条带的为雌性。通过本发明专利技术的PCR引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，利用电泳检测结果目的条带的有无来确定双须骨舌鱼的性别，操作简单方便，鉴别结果快速准确。实现了双须骨舌鱼性别的非损伤准确鉴定。实现了双须骨舌鱼性别的非损伤准确鉴定。实现了双须骨舌鱼性别的非损伤准确鉴定。

【技术实现步骤摘要】
一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物以及鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物以及鉴定方法。

技术介绍

[0002]骨舌鱼，俗称龙鱼，是一种古老的“活化石”鱼类，具有较高的经济价值、科研价值和社会价值。在我国市场最常见是美丽硬仆骨舌鱼(金龙鱼)和双须骨舌鱼(银龙鱼)。骨舌鱼雌雄鱼在外部形态上不能区分，即使是在生殖季节，也很难准确辨别性别。目前仍没有不伤害鱼的前提下准确性别鉴定方法，产业上仍以群体繁育为主，导致繁殖效率不高，且其繁殖周期长，亲本群体珍贵，影响产业发展。因此如何实现骨舌鱼性别的非损伤鉴别成为产业中亟需解决一大难题。
[0003]基于性别特异性分子标记，可以简单快速地实现遗传性别。专利CN105368948A公开了一种尼罗罗非鱼性别PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，所述引物能够对尼罗罗非鱼的AMH基因进行特异性扩增，雄性个体生成2条特异性扩增片段，长度分别为：179bp和412bp，雌性个体生成1条长度为412bp的特异性扩增片段。能够明显区分，因而可以简单、精确地对尼罗罗非鱼的性别进行鉴定。专利CN 112029843 A公开了一种鉴定金钱鱼遗传性别的特异性分子标记及其引物和应用。所述分子标记为两条在金钱鱼X染色体和Y染色体中部分同源的DNA片段，该专利技术从金钱鱼基因组信息中筛选到两条在金钱鱼X染色体和Y染色体上部分同源DNA片段，并设计特异性引物进行金钱鱼遗传性别鉴定，可以快速、准确地区分金钱鱼遗传性别。专利CN 112725427 A公开了一种基于荧光PCR技术鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒，所述引物和荧光探针包括基于鲟鱼W染色体特异DNA序列设计的引物WF、引物WR和荧光探针W以及基于鲟鱼Z染色体特异DNA序列设计的引物ZF、引物ZR和荧光探针Z，所述试剂盒包括荧光PCR反应液、TaqDNA聚合酶、阴性对照和阳性对照，所述荧光PCR反应液包括上述引物和荧光探针；鲟鱼基因组样品在进行荧光PCR扩增后，进行Ct值分析；若两组引物的荧光PCR结果均为阳性，则待测样品为雌性；若W染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阴性而Z染色体特异DNA序列引物的荧光PCR结果为阳性时待测样品为雄性。
[0004]上述现有技术均是基于不同鱼类的性别特异性分子标记以实现性别鉴定。但目前仍未有关于双须骨舌鱼特异性分子标记性别鉴定的方法公开。现有技术未能获得双须骨舌鱼性别特异性DNA片段，也未能根据特异性片段设计相应的引物。

技术实现思路

[0005]针对双须骨舌鱼非损伤鉴别的难点，本专利技术的首要目的在于提供一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种双须骨舌鱼性别鉴定的方法。
[0007]通过本专利技术的PCR引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果目的条带的有无来确定双须骨舌鱼(银龙鱼)的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于推广
和使用，具有广阔的应用前景。
[0008]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0009]一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物，所述引物序列如下：
[0010]YL_F：AACACCCAGAGCTGTTCGAC(SEQ ID NO：1)；
[0011]YL_R：CAAGCCCTTTGTAGACCATCTA(SEQ ID NO：2)。
[0012]一种双须骨舌鱼性别鉴定的方法，包括如下步骤：
[0013]利用上述PCR引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，结果无特异性条带的为雄性，有810bp条带的为雌性。
[0014]进一步地，所述PCR扩增反应条件为：
[0015]PCR反应总体积为25μL，包括：10
×
Buffer2.5μL，Mg
2+
1μL，dNTPs1μL，上下游引物各1μL，模版DNA1μL，TaqDNA聚合酶1U，ddH2O适量。
[0016]进一步地，所述Mg
2+
浓度为25mmol/L，dNTPs浓度为2mmol/L，上下游引物浓度为10μmol/L，模版DNA浓度为50ng/μL。
[0017]进一步地，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。
[0018]进一步地，所述PCR扩增反应扩增片段序列为SEQ ID NO：3。
[0019]进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳检测采用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分离，设定电压为120V，时间为20min，后经凝胶成像仪观察、拍照。
[0020]本专利技术原理为：通过雌性和雄性双须骨舌鱼基因组三代测序，结合5雌和5雄基因组重测序精细比对以及109尾个体(51雌和58雄)混合样品测序结果，筛选得到性别特异性分子标记，确定了双须骨舌鱼的性染色体，并在性染色体上获得雌性特异的基因组DNA序列。在雌性特异性DNA序列中设计上游引物，在特异性区域外设计下游引物，PCR扩增后雄性无特异性条带，雌性有810bp条带。
[0021]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0022](1)通过本专利技术的PCR引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，利用电泳检测结果目的条带的有无来确定双须骨舌鱼的性别，操作简单方便，鉴别结果快速准确。实现了双须骨舌鱼性别的准确鉴定。
[0023](2)通过基因组高通量测序对比银龙鱼雌雄个体之间基因组差异序列，获得大小为510bp的雌性特异性DNA片段(具体核苷酸序列为SEQ ID NO：4)。根据特异性片段列设计的引物经扩增可获得包含差异序列的产物，从而依据特异性片段扩增差异鉴别待测样本的性别。且本专利技术通过PCR扩增即能完成性别的鉴定，不需经过测序等方法，操作简便且节省时间和成本。较于其他操作繁琐、耗时长的分子鉴定方法，本专利技术更适用于对大批量样本进行快速鉴定。更重要的是，依据本专利技术的PCR引物能够简单、准确、快速的鉴别双须骨舌鱼的性别，且不需要进行双须骨舌鱼的解剖，基本不影响被测样本的健康状况，便于实现在养殖技术上的应用，实现双须骨舌鱼的性别配对，大大提高繁殖效率、繁殖成功率和后代的数量，解决双须骨舌鱼繁育的重大产业问题，具有重要的经济价值和社会价值。
附图说明
[0024]图1为本专利技术实施例中双须骨舌鱼性别鉴定的琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。
[0026]实施例1
[0027](1)双须骨舌鱼性别特异性分子标记的筛选：
[0028]采用高通量测序策略，选择5例雌性龙鱼样品和5例雄鱼样品进行DNA的提取，根据Illumina文库构建流程要求，构建插入片段大小为500bp的双末端基因组DNA文库。然后采用Illumina NovaSeq测序平台对基因组进行高通量测序，每样品测序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双须骨舌鱼性别鉴定的PCR引物，其特征在于，所述引物序列如下：YL_F：AACACCCAGAGCTGTTCGAC；YL_R：CAAGCCCTTTGTAGACCATCTA。2.一种双须骨舌鱼性别鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求1的PCR引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳检测，结果无特异性条带的为雄性，有810bp条带的为雌性。3.根据权利要求2所述的一种双须骨舌鱼性别鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：PCR反应总体积为25μL，包括：10
×
Buffer 2.5μL，Mg
2+
1μL，dNTPs 1μL，上下游引物各1μL，模版DNA1μL，TaqDNA聚合酶1U，ddH2O适量。4.根据权利要求3所述的一种双须骨舌鱼性...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘奕，牟希东，杨叶欣，刘超，宋红梅，徐猛，房苗，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院珠江水产研究所，
类型：发明
国别省市：