从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：

【技术实现步骤摘要】
从胎盘组织中扩增自然杀伤细胞的方法


[0001]本专利技术涉及一种从胎盘绒毛小叶组织及胎盘血来源细胞的培养扩增自然杀伤细胞的方法，属于生物工程


技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(NK细胞)于30年前在外周血中被发现，CD3
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CD56+淋巴细胞被定义为人NK细胞。NK细胞通常含有大量穿孔素(perforin)和颗粒酶B(granzyme B)，当激活的NK细胞遇到靶细胞时，NK细胞释放穿孔素和颗粒酶B攻击靶细胞。NK细胞还可以分泌IFN
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γ、TNF
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α、GM
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CSF和IL
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3等细胞因子，这些细胞因子可以直接作用于靶细胞，也可以通过激活其他种类的免疫细胞攻击靶细胞。
[0003]有文献(Koepsell SA,Miller JS,McKenna DH Jr.Natural killer cells:a review of manufacturing and clinical utility.Transfusion.2013,53(2):404
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10)报道，浸润到肿瘤组织中的NK细胞数量尽管非常少，但是NK细胞浸润到肿瘤组织的患者能明显的观察到其生存期的显著延长，及其肿瘤扩散比率的显著降低。与健康人的NK细胞相比，肿瘤患者NK细胞浸润到肿瘤组织中的杀伤能力显著降低。
[0004]另外，肿瘤患者的NK细胞表面抑制受体如CD158a、CD158b和NKG2A表达显著上升，而激活受体如NKG2D、NKG2C、NPp30和CD69则显著下降。现有研究数据表明，癌症患者的NK细胞严重受损，这使得它们无法消灭肿瘤细胞。但这为肿瘤的免疫治疗提供了一个契机，即通过体外细胞活化和扩增的方法恢复或者重建NK细胞抗肿瘤的能力，提高NK细胞对肿瘤免疫治疗的效果。已经报道的许多临床前研究表明，NK细胞作为一种有效地免疫治疗方法可以用于治疗各种肿瘤。
[0005]一些NK细胞临床研究的细胞制备方法已经有可能被转化成为临床级或者是cGMP级的标准制备过程(Lapteva N,Durett AG,et al.Large
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scale ex vivo expansion and characterization of natural killer cells for clinical applications.Cytotherapy.2012,14(9):1131
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43)。在这些报道的NK细胞制备方法中，大多使用外周血、脐血、骨髓中的单个核细胞作为培养NK细胞的样本。另外，还有文献(Campbell KS,Hasegawa J.Natural killer cell biology:an update and future directions.J Allergy Clin Immunol.2013,132(3):536
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44)报道，体外扩增NK细胞，有多种因素都会影响到NK细胞的数量，从而降低NK细胞扩增的可能性。
[0006]胎盘作为连接胎儿和母体的重要器官，其结构较为复杂，至少可分为胎盘脐带连接、羊膜包被层、绒毛膜板、绒毛组织、底蜕膜等包含不同种类细胞的组织。现有研究表明，同一份胎盘至少可以获得包括造血(祖)干细胞、绒毛血管内皮干细胞以及绒毛膜、羊膜以及绒毛组织来源的间充质干细胞等不同种类的细胞。胎盘在胎儿发育早期也是重要的造血器官，研究表明，绒毛及其绒毛小叶结构中血管成分来源的内皮干细胞和造血祖细胞，在造血过程起着重要作用。在胎盘发育早期存在造血内皮组织，主要存在绒毛小叶结构之中，胎盘小叶结构中的血管内皮在一定条件下可以从血管内皮脱落、或造血内皮细胞失去表达钙
黏素5发育成为血液中的悬浮细胞，成为具备造血分化功能的干细胞。
[0007]胎儿分娩后胎盘中不仅留存着丰富的造血前体或造血(祖)干细胞，而且可分离得到大量的原始免疫细胞，再经体外扩增诱导为NK等过继性免疫治疗细胞用于临床辅助回输治疗。当前脐带血造血干细胞移植中造血(祖)干细胞(CD34+)细胞数量已成为临床移植植入的关键因素之一，然而单份脐带血CD34+细胞数量有限，造成植入周期较长，临床治疗费用较高，增加移植临床的风险。解决当前脐带血造血干细胞数量，可以在移植后给予辅助淋巴细胞输注提高植入效率，也可以采用移植时辅助给予间充质干细胞输注以降低GvHD不良反应。但这些措施一般只采用异体来源的淋巴细胞或间充质干细胞辅助移植，会因引入异源细胞或抗原增加负反应强度和几率，进而增加临床移植失败的风险。
[0008]NK细胞主要分布于外周血液、肝脏、脾脏、围产期组织等，目前采集NK细胞的主要方式主要有两种：一种为通过静脉抽取外周血来制备获得NK细胞；另外一种则通过围产期组织来获取NK细胞及制备。由于部分人群痛觉神经较为敏感，且NK细胞在外周血的含量极低，因此抽取的外周血需要达到足够的数量才能满足临床治疗的需要。相对于此种方式，采用围产期组织来获取NK细胞无疑是更具有无可比拟的优势，尤其是新生儿围产组织胎盘中富含大量的NK细胞。而且围产组织来源的NK细胞会更原始，纯净度更高、干扰素表达能力更强，拥有更强的骨髓归巢功能，但同时免疫原性也更低，这不但规避了需要采集大量外周血液繁琐的步骤，同时也保证采集过程中人不会感受到痛苦。尤其是相较于成年人来讲，未成年人的免疫系统还不够完善，并不适用于静脉抽血的方式进行NK细胞的采集及后续的治疗，因此对于这部分特定的人群来说，围产期胎盘组织无疑是最理想的NK细胞来源。
[0009]目前NK细胞培养扩增的方法主要有两种，第一种是主要以滋养层细胞与NK细胞共培养来刺激NK细胞的增殖能力的，该方法虽然价格便宜、效果较稳定，并且能够获得数量可观的NK细胞，但其仍然存在诸多缺点，尤其是在临床应用中，其主要原因在于培养过程中选用的滋养层细胞为多为肿瘤细胞。尽管从理论上讲，经过相应处理的肿瘤细胞已经不再具备增殖的可能性。但其潜在风险难以证明可以完全排除。另外就是伦理方面的问题，将正常细胞与肿瘤细胞共培养，然后将培养后的NK细胞回输体内，确实存在难以克服的伦理障碍。另一种方法是细胞因子诱导扩增NK细胞，向NK细胞方向诱导，并配合相应的细胞培养基，使NK细胞大量增殖。纯因子细胞培养技术以其安全性高而著称，其原因在于所使用的细胞因子，都是体内环境原本就存在的。培养过程相当于模拟体内环境，促进NK细胞的激活及大量增殖。但目前采用传统细胞因子的方法如，白细胞介素
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2(IL
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2)等，不但价格昂贵，体外扩增NK细胞的效果也不甚理想。因此亟需寻求一种新型的细胞因子，可高效的扩增NK细胞。
[0010]FLT3配体(FLT3
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ligand，FL)是一种能够调节早期造血的关键性细胞因子，与III型酪氨酸激酶受体FLT3(FMS
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like tryosinekinase 3)结合，在多种疾病的病理生理过程中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.培养自然杀伤细胞的方法，其包括如下步骤：(1)将细胞密度为0.5～1.5
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106/mL(例如1
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106/mL)胎盘MNC细胞悬液(例如20mL)接种至一个培养瓶(例如T75培养瓶)中，然后向培养瓶中添加IL
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15 50ng/mL、FLT3
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L 10ng/mL、OK432 10ng/mL，混匀后将培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中培养；(2)每48h向培养瓶中补加IL
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15 50ng/mL、FLT3
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L 10ng/mL、OK43210ng/mL，每48～72h向培养瓶中补加NK细胞完全培养基，并调整细胞密度为0.5～1.5
×
106/mL，当培养的细胞悬液总体积达到200ml时，将细胞悬液转移至G
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rex培养瓶中继续培养至14天；(3)培养结束后，将细胞悬液吸出至离心瓶中，1500rpm、8min、25℃离心；结束后弃上清液，用PBS重悬细胞沉淀，得到自然杀伤细胞。2.根据权利要求1的方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中随所述IL
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15一起还添加硝酸亚铁7μg/ml和苏氨酸60μg/ml；所述NK细胞完全培养基是以X vivo 15培养基作为基础培养基，在其中增补添加2.5％血清替代物、1mM酪氨酸、2mM的L
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谷氨酰胺；和/或所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。3.根据权利要求1的方法，所述胎盘MNC细胞悬液是照包括如下步骤的方法制备得到的：(i)将胎盘血和胎盘小叶组织细胞悬液混匀，用无菌注射器抽取混合液注入到含抗凝剂3.2％枸橼酸钠溶液的采血袋内，抗凝剂与生物样本的体积比为1：12，混匀后放置于摇摆器上慢速摇摆15min；(ii)将自动化分离设备的一次性使用分离杯的塑料针头插入到采血袋上的无菌接口内，将采血袋挂起，使其中的血液自然流入分离杯内的中央舱室；用无菌接合仪焊接管路将血液采集袋与一次性分离杯分离；(iii)将一次性分离杯配平后放置于市售的可编程的离心机中进行离心操作，离心程序参数如下：序参数如下：执行上述离心操作后从一次性分离杯的回收舱室获得细胞浓缩层，用NK细胞完全培养基将该细胞浓缩层稀释并调整细胞密度，得到胎盘MNC细胞悬液。4.根据权利要求3的方法，所述胎盘血是照包括如下步骤的方法制备得到的：(a)胎盘清洗：使用手术镊将胎盘组织取出，放入不锈钢托盘中，用含青霉素
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链霉素
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两性霉素的组织清洗液对胎盘表面进行冲洗，去除表面上的凝血污渍；(b)用剪刀、镊子钝性剥离并丢弃胎盘表面的羊膜层，剪去其上的脐带组织；然后用剪刀将剩余的胎盘小叶组织剪成3～7cm3的小块，取一300目不锈钢过滤网放置在不锈钢杯上，将小块胎盘小叶组织放在300目不锈钢过滤网上，用勺子挤压全部的胎盘小叶组织，以挤出其内的胎盘血流入至不锈钢杯内，收集胎盘血。5.根据权利要求3的方法，所述组织清洗液是通过如下方式配制所得溶液：用0.9％氯化钠注射液配制成含青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml和0.25μg/ml两性霉素B的溶液，过滤除菌，即得。6.根据权利要求3的方法，所述胎盘小叶组织细胞悬液是照包括如下步骤的方法制备得到的：(c)在250ml离心杯中添加25～30mL的HBSS缓冲液，将挤压完胎盘血的胎盘小叶组织小块放入离心杯中，用剪子将小叶组织进一步剪碎成0.5～1mm3，然后转移至300目筛网上，用HBSS缓冲液进行过滤，并使用HBSS缓冲液再清洗两次，清洗至滤液清澈；将清洗后的组织加入已预热至37℃的组织消化液100mL中，充分混匀，用封口膜封口后，于摇床中振荡消化30min(37℃，100rpm)；(d)消化结束后，将装组织消化液的离心杯放入安全柜，倒入组织清洗液，使用300目滤网过滤；再用400ml组织清洗液多次洗涤组织，收集滤清液；将滤清液倾倒入若干250mL离心杯中，放入离心机，进行1500rpm、8min、25℃离心；离心结束后，弃上清液，再次用组织清洗液重悬细胞沉淀，充分混匀后再次以1500rpm、8min、25℃离心；(e)离心结束后，弃上清，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞悬液，至50ml离心管中，以1800rpm、10min、25℃离心，离心结束后弃上清液，收集细胞沉淀，用PBS重悬，得到胎盘小叶组织细胞悬液。7.根据权利要求1的方法，所述组织消化液是照如下方式制备得到的：
①
向I型胶原酶粉末中添加PBS，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/ml的I型胶原酶溶液；
②
向II型胶原酶粉末中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的II型胶原酶溶液；
③
向DNA酶中添加HBSS缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的DNA酶溶液；
④
向嗜热菌蛋白酶粉末中添加缓冲液，充分混匀溶解，配置成浓度为10mg/mL的蛋白酶溶液；
⑤
将以上所得I型胶原酶溶液、II型胶原酶溶液、DNA酶溶液、蛋白酶溶液按5：5：7：5的比例进行混合，配置成为组织消化液。8.根据权利要求1的方法，所述PBS是PH6.8的磷酸盐缓冲液，其制法是：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。9.根据权利要求1的方法，所述HBSS缓冲液是通过如下方式配制所得溶液：将8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.1g的MgSO4
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7H2O、0.1g的MgCl2
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6H2O、0.06g的Na2HPO4
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2H2O、0.06g的K...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏卿，肖海蓉，刘庆喜，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：