用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于医学实验模型研究技术领域，针对“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，公开了一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法。所述试剂盒包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL

【技术实现步骤摘要】
用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于医学实验模型研究
，具体为一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]自身免疫性肝炎是一种针对肝细胞的异常免疫反应导致的慢性进行性肝病，其特点是免疫球蛋白水平升高、自身抗肝抗原抗体的存在、形态学表现为界面型肝炎。自身免疫性肝炎患者会出现血清转氨酶升高、炎性细胞因子的异常表达，以及严重的肝坏死和细胞凋亡，如果不及时治疗，可能会发展为肝纤维化、肝功能衰竭等。本病的病因以及发病机制尚不清楚，目前认为是由于遗传易感性及环境诱发因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失，从而诱导产生以T细胞介导为主的针对肝脏抗原的免疫反应，造成肝脏组织的破坏及炎症的形成。
[0003]自身免疫性肝炎动物模型的研究已有较好的发展，但有关可以用于自身免疫性肝炎发病机制及治疗机制的细胞模型相对较少。尤其是可以快速、稳定、简便地体外模拟T细胞介导肝细胞损伤的病理生理过程的细胞模型，目前尚未见相关报道。这在一定程度上，阻碍了自身免疫肝炎发病机制及治疗机制的研究进展，如开展目的基因过表达或沉默研究等。因此，如能制备一款可以快速、稳定、一站式地建立“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型，将有助于自身免疫性肝炎的发病机制研究及开发有效的治疗药物。

技术实现思路

[0004]针对“T细胞介导肝细胞损伤”的体外研究模型对自身免疫性肝炎发病机制的研究及有效治疗药物开发的重要性，本专利技术提供了一种可用于快速建立人源性“T细胞介导肝细胞损伤”体外研究模型的试剂盒及方法。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0006]本专利技术提供一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL
‑
7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28 T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。本试剂盒仅用于科学研究，不用于临床诊断或治疗。
[0007]进一步，所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基由79％RPMI
‑
1640(V/V％)、20％胎牛血清(V/V％)和1％100U/mL青链霉素双抗混合液(V/V％)组成，
‑
20℃保存。
[0008]进一步，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的使用浓度为25μL/mL，储存条件为2
‑
8℃。
[0009]进一步，所述细胞消化液为用所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基配置的0.25％胰酶溶液(wt％)，
‑
20℃保存。
[0010]进一步，所述灭菌PBS的质量百分比为5％，保存于
‑
20℃。
[0011]本专利技术还提供一种基于上述试剂盒建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，包括以下步骤：先将T细胞和肝细胞在专用培养基内进行共培养，建立“T细胞/肝细胞共培养
体系”，然后通过T细胞激活物的诱导活化T细胞，以造成肝细胞损伤，从而建立了“T细胞介导肝细胞损伤”体外研究模型，即本专利技术所述的用于自身免疫性肝炎体外研究的模型，从而用于体外模拟自身免疫性肝炎的部分发病机制。T细胞激活物为由可结合CD3和CD28的可溶性抗体复合物组成的人CD3/CD28 T细胞激活剂，可以为T细胞激活提供所需的初级和共刺激信号，活化T细胞后，通过表达IFN
‑
γ、TNF
‑
α等细胞因子，引起肝细胞损伤。
[0012]进一步，所述建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，具体包括以下步骤：
[0013]将HL
‑
7702人肝细胞按细胞数为5
×
105个/孔的标准用100μL的T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养至贴壁；
[0014]将Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞采用T细胞/肝细胞共培养专用培养基无菌恒温培养，进行常规传代、换液后，调整至5
×
106个/mL备用；
[0015]在培养至已贴壁的HL
‑
7702人肝细胞培养孔内，吸弃原有培养基，用灭菌的质量百分比为5％的PBS溶液洗2次后，每孔加入100μL已调整细胞浓度的Jurkat细胞悬液，继续共培养12h；
[0016]在上述共培养体系内，按2.5μL/孔的剂量加入人CD3/CD28 T细胞激活剂，继续培养12h，即获得自身免疫性肝炎体外研究模型。
[0017]进一步，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的浓度为25μL/mL。
[0018]进一步，所述HL
‑
7702人肝细胞和Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞的培养条件为：37℃，5％CO2，PH值7.2
‑
7.4。
[0019]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0020](1)本试剂盒具备建立“T细胞介导肝细胞损伤”细胞模型的全部试剂，可以达到“一站式”建立的程度。
[0021](2)本试剂盒采用人CD3/CD28 T细胞激活剂，可以为T细胞激活提供所必需的初级和共刺激信号，并可以确定激活剂的使用量，同时可以根据实验规模具体调整激活剂的使用量，与传统的单用anti
‑
CD3和CD28抗体的方法比较，更为简便和稳定。
[0022](3)本试剂盒诱导肝细胞损伤的方法耗时较短，仅用36小时即可有效地造成肝细胞出现明显的损伤，大大地缩减的模型建立的时间。
[0023](4)本试剂盒均采用人类细胞，模型的建立更加符合人类自身免疫性肝炎的发生发展特征，在后续实验研究中可以降低种属差异对实验结果的影响。
[0024](5)填补自身免疫性肝炎细胞模型建立研究的空白。
附图说明
[0025]图1为本专利技术实施例3的方法流程图。
[0026]图2为Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞未激活与激活后的比较图。
[0027]图3为Jurkat/HL
‑
7702人肝细胞共培养后肝细胞损伤情况。
具体实施方式
[0028]下面结合本专利技术实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本专利技术的保护范围。
[0029]实施例1
[0030]一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒
[0031]试剂盒的组成：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL
‑
7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28 T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。
[0032]1)Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞
[0033]细胞描述：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞。该株细胞是Jurkat
‑
FHCRC细胞株(Jurkat细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，包括：Jurkat人T淋巴细胞白血病细胞、HL
‑
7702人肝细胞、T细胞/肝细胞共培养专用培养基、人CD3/CD28 T细胞激活剂、细胞消化液、灭菌PBS溶液。2.根据权利要求1所述的用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基由体积百分比为79％的RPMI
‑
1640、体积百分比为20％的胎牛血清和体积百分比为1％的100U/mL青链霉素双抗混合液组成，
‑
20℃保存。3.根据权利要求1所述的用于建立自身免疫性肝炎体外研究模型的试剂盒，其特征在于，所述人CD3/CD28 T细胞激活剂的使用浓度为25μL/mL，储存条件为2
‑
8℃；所述细胞消化液为用所述T细胞/肝细胞共培养专用培养基配制的质量百分比为0.25％的胰酶溶液，
‑
20℃保存；所述灭菌PBS的质量百分比为5％，
‑
20℃保存。4.一种基于权利要求1
‑
3任一项所述的试剂盒建立自身免疫性肝炎体外研究模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：先将T细胞和肝细胞在专用培养基内进行共培养，建立“T细胞/肝细胞共培养体系”，然后通过T细胞激活物的诱导，活化T细胞，建立了...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝慧琴，刘杨，刘莹，
申请(专利权)人：山西中医药大学，
类型：发明
国别省市：