一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法技术

本发明专利技术提供了一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和细胞扩增培养方法。该培养基为基础培养基中含有3～10％的FBS、10～50U/mL的IL

【技术实现步骤摘要】
一种CD3+TCRV
α
7.2+T细胞培养基和扩增培养方法


[0001]本专利技术属于生物领域，具体涉及一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基和扩增培养方法。

技术介绍

[0002]目前关于CD3+TCRVα7.2+T细胞的研究较少，但MAIT细胞(其表型是CD3+TCRVα7.2+CD161+)的获取、培养方式主要有以下几种：
[0003]i.取自健康志愿者的新鲜的外周血(PBMC)，用抗体
‑
Microbeads偶联的方式分选获得CD161+的细胞，立即对分出的细胞进行抗体染色，采用流式分选仪获得CD3+TCRVα7.2+CD161+的细胞，采用完全培养基(50％AIMV+50％RPMI1640+10％FBS+谷氨酰胺+β
‑
巯基乙醇)培养，细胞密度范围在5E+05～2E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO2(卢湧湧，膀胱癌患者体内粘膜相关恒定T细胞(MAIT)的数量、功能及其抗肿瘤作用研究，2017学位论文，山东大学)。
[0004]ii.用抗CD3磁珠和Auto MACS分离CD3+T细胞，纯化后分别用抗CD4、抗CD161和抗TCRVα7.2的抗体染色，经过流式分选获得MAIT细胞(CD4﹣CD161+TCRVα7.2+T)细胞。分选后当天用CD3和CD28的抗体激活三天，洗去抗体后继续扩大培养，培养基为含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640，细胞密度约1E+06个细胞/mL，培养箱环境是37℃，5％CO2(Duan,M.,et al.,Activated and Exhausted MAIT Cells Foster Disease Progression and Indicate Poor Outcome in Hepatocellular Carcinoma.Clin Cancer Res,2019.25(11):p.3304
‑
3316)。
[0005]iii.收集健康志愿者的PBMC，采用流式分选仪获得MAIT细胞，原代人MAIT细胞在混合培养基中培养21天。培养基成分包括：50％AIMV、50％RPMI 1640、10％FBS、2％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺、0.1mM丙酮酸钠、15mM的HEPES buffer、PH＝7.2
‑
7.5、50U/mL rhu IL
‑
2、10ng/mL rhu IL
‑
7、50ng/mL rhu IL
‑
12、50ng/mL IL
‑
15、50U/mL IL
‑
18、50μM的2
‑
巯基乙醇。在培养的第1、5、10天分别加入50nM的5
‑
OP
‑
RU，从第10天起去掉其中的IL
‑
12、IL
‑
18和IL
‑
7(Gherardin,N.A.,et al.,Enumeration,functional responses and cytotoxic capacity of MAIT cells in newly diagnosed and relapsed multiple myeloma.Sci Rep,2018.8(1):p.4159)。
[0006]iv.取健康志愿者的PBMC，抗CD8磁珠和Auto MACS(Miltenyi Biotech)分离CD8+T细胞，立即对分出的细胞进行抗体染色，采用流式分选仪获得CD3+CD8+TCRVα7.2+CD161+的细胞，用抗CD3和CD28的抗体激活后，采用R10完全培养基(含有10％FBS、1％L
‑
谷氨酰胺、1％的青霉素/链霉素、50ng/mL rhu IL
‑
12、50ng/mL IL
‑
15、50U/mL IL
‑
18的RPMI 1640培养基)培养，细胞密度范围在1E+06个/mL左右，培养箱环境是37℃，5％CO2(Leng,T.Q.,et al.,TCR and Inflammatory Signals Tune Human MAIT Cells to Exert Specific Tissue Repair and Effector Functions.Cell Reports,2019.28(12):p.3077
‑
+)。
[0007]v.取健康志愿者的PBMC，加入Ficoll离心，密度梯度法分出PBMC后用1640完全培
养基(RPMI 1640培养基加入10％FBS、1％青霉素
‑
链霉素、10mM HEPES缓冲液、0.1mM MEM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠和5.5mM 2
‑
巯基乙醇)重悬，计数。通过负载5
‑
OP
‑
RU的MR1四聚体或与抗CD161和TCRVα7.2的抗体共同染色，流式细胞术检测人MAIT细胞占比(图1)。
[0008]用Sulfate Latex Beads与CD28抗体、5
‑
OP
‑
RU/MR1tetramer在4℃摇床孵育12小时，充分洗涤后制备得到5
‑
OP
‑
RU/MR1人工抗原提呈细胞(5
‑
OP
‑
RU/MR1 aAPCs)，只孵育了CD28的beads作为对照。将上述PBMC用1640完全培养基重悬，密度调节到5E+06/mL，装到96孔板，每孔5E+05，培养基补至200μL，每孔加40U/mL的IL
‑
2和0.5μL上述5
‑
OP
‑
RU/MR1aAPCs，充分混匀后在37℃，5％CO2的培养箱中培养。在第三天半数换液，继续培养七天后流式细胞术检测MAIT细胞占比(图2)。收集扩增后的PBMC，加含有0.5％FBS的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后，用200μL RPMI1640完全培养基重悬，加入1μL上述自制的APC
‑
labeled5
‑
OP
‑
RU/MR1tetramer，混匀后在冰上孵育45分钟，用含有0.5％FBS的PBS洗两次后加入一定的PBS重悬，加入抗APC的磁珠，充分孵育后洗涤干净，用MACS柱子分选获得MAIT细胞(图3)。用含有0.5％FBS的PBS洗去MAIT细胞中的分选液后用RPMI 1640完全培养基重悬MAIT细胞，在37℃，5％CO2的培养箱中继续扩增(Liu,C.,T
‑
Cell Receptor Signaling.Springer Nature Book,2020)。
[0009]尽管存在以上多种获得MAIT的方法，但是MAIT细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基，其特征在于，为基础培养基中含有3～10％的FBS、10～50U/mL的IL
‑
2、10～50ng/mL的IL
‑
15；所述基础培养基选自RPMI 1640培养基、T009培养基、AIMV培养基、DMEM培养基、X
‑
VIVO培养基中的一种或多种。2.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基，其特征在于，还含有1％
±
0.5％100X青霉素
‑
链霉素、1％
±
0.5％L
‑
谷氨酰胺、1％
±
0.5％非必需氨基酸。3.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基，其特征在于，还含有5～30ng/mLIL
‑
7、20～50ng/mLIL
‑
12或20～50ng/mLIL
‑
18。4.如权利要求1所述的CD3+TCRVα7.2+T细胞培养基，其特征在于，含有20～50ng/mL的IL
‑
15。5.一种CD3+TCRVα7.2+T细胞扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、细胞采集；S2、采用方法a或方法b进行CD3+TCRVα7.2+T细胞的分离；所述方法a：采用CD3磁珠分选出CD3+T细胞，再用抗人TCRVα7.2抗体和抗PE/APC/FITC磁珠分选得到CD3+TCRVα7.2+T细胞；所述方法b：采用流式细胞分选技术；S3、采用方法c、方...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾裕杰，徐南，康立清，俞磊，谭靖雯，叶晶，方小燕，王依婷，
申请(专利权)人：上海优卡迪生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：