用于诱导造血细胞分化的方法和组合物技术

本发明专利技术提供了将多能细胞分化为造血细胞的培养平台、细胞培养基和方法。本发明专利技术进一步提供了使用本文公开的培养平台和方法产生的多能干细胞来源的造血细胞，其能够无饲养、单层培养和不进行EB形成。特别的，本发明专利技术的多能干细胞来源的造血细胞包括和不限于iHSC、永久造血内皮、造血专能祖细胞、T祖细胞、NK祖细胞、T细胞和NK细胞。T细胞和NK细胞。

【技术实现步骤摘要】
用于诱导造血细胞分化的方法和组合物
[0001]本申请是申请日为2016年1月26日，申请号为201680018703.4，名称为“用于诱导造血细胞分化的方法和组合物”的中国专利技术专利申请的分案申请。
[0002]关联申请
[0003]本申请要求2015年1月26日提交的美国临时申请号62/107,517和2015年11月4日提交的美国临时专利申请号62/251,016的优先权，其在此全文引入作为参考。


[0004]本专利技术一般涉及用于从多能干细胞生产所有造血谱系细胞的组合物和方法。特别的，本专利技术涉及从多能干细胞，包括人诱导性多能干细胞生产所有造血谱系细胞的改进的培养平台。
[0005]背景
[0006]人诱导性多能干细胞(hiPSC)技术代表了用于治疗包括癌症在内的许多血液学和非血液学恶性肿瘤的治疗上可行的造血细胞的非常有希望和可能无限的来源。为了推进hiPSC和基因工程改造的hiPSC技术作为造血细胞治疗的同种异体来源的前景，必须能够不仅有效和可重复地产生造血干细胞和祖细胞(HSC)，而且还产生免疫效应物种群，包括T、B、NKT和NK淋巴样细胞及其祖细胞的多样性子集。
[0007]由于在胚胎发育期间存在至少两个在时间和空间上不同的血液形成阶段(waves)——原始(primitive)造血和永久(definitive)造血——的原因，具有产生淋巴细胞潜能的HSC的体外衍生是复杂的。原始造血发生在胚外卵黄囊中，并产生主要包括原始红细胞和骨髓细胞而不是HSC的瞬时和限制性造血细胞。最初的HSC仅在来自称为永久造血内皮(HE)的动脉血管内的特异性内皮祖细胞的最终阶段中才出现。然后永久HE经历内皮细胞
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造血过渡以产生HSC，然后HSC在整个成年期间最终迁移到骨髓，在那里它们维持多系血细胞生成，包括T、B、NKT和NK淋巴样细胞。因此，来自多能干细胞的HSC和淋巴样效应细胞的产生取决于通过精心设计和验证的方法和组合物，将早期胚胎造血发育的复杂阶段准确地重整(recapitulate)为永久程序的能力。
[0008]有限数量的研究已经描述了hiPSC在体外向永久的HE的直接分化。将hiPSC用于治疗目的的主要障碍是需要在存在不明确含血清培养基的情况下，首先将这些细胞与鼠源或人源性基质细胞共培养，以保持多能性并诱导分化。此外，现有的方案还采用了包括将iPSC培养形成胚状体(EB)的策略，后者是包含外胚层，中胚层和内胚层细胞的各种分化细胞的细胞的不均匀聚集体。这些方法需要通过例如旋转来聚集多能细胞以形成团块，允许细胞沉降并聚集在孔中或允许悬浮培养物中的被动聚集和团块形成。形成的EB在分化诱导培养系统中保持一定持续时间，通常为7至10天，以允许适当的分化，然后将EB转移至贴壁培养以进一步成熟，或解离成单个细胞用于细胞类型选择，以便进行到随后的分化步骤。(Kennedy等，Cell Reports 2012:1722
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1735；Knorr等，Stem Cell Translational Medicine 2013(2):274
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283)。例如，Kennedy等教导产生用于iPSC分化的EB，其中多能细胞用胶原酶和胰蛋白酶处理以允许剥下(scraping)细胞形成小的聚集体，然后将其培养形成
EB。已经显示EB的形成促进多能干细胞分化，然而，形成聚集体和随后的EB的需求是劳动密集型的，细胞数量在该过程中最小程度地增加，三维EB聚集体中的细胞内容物不一致并且不均匀地暴露于培养基因子，这导致形成处于不同分化阶段的异质细胞产品，并且极大地阻碍了要求有效和流水线的制造过程的可扩展性和可再现性。
[0009]因此，需要不依赖于共培养或含血清培养基且不需要形成胚状体聚集体作为中间体的将干细胞分化为永久性造血细胞的方法和组合物。
[0010]专利技术概述
[0011]本专利技术一般涉及用于培养和将干细胞分化为造血细胞命运(fate)的细胞培养条件、培养基、培养平台和方法。
[0012]具体而言，本专利技术提供了在血清/无饲养条件下，且在可扩展和单层培养平台中，不需要EB形成的情况下，通过来自多能干细胞(包括hiPSC)的永久造血内皮(HE)和永久造血干细胞(HSC)产生造血细胞谱系的方法和组合物。可以根据本专利技术的方法分化的细胞的范围从多能干细胞到确定为特定末端分化细胞和转分化细胞的祖细胞，各种谱系的细胞不通过多能中间体直接转化成造血命运。类似地，通过干细胞分化产生的细胞范围从专能干细胞或祖细胞到终末分化的干细胞，以及所有中间的造血细胞谱系。
[0013]本专利技术提供了用于在单层培养中从多能干细胞分化和扩增造血谱系细胞的方法和组合物，其包括使多能性固体细胞与BMP途径激活剂和任选的bFGF接触。从而，获得并扩增了多能干细胞来源的中胚层细胞，而不从多能干细胞形成胚状体。然后使中胚层细胞与BMP途径激活剂、bFGF和WNT途径激活剂接触，以获得具有永久造血内皮(HE)潜能的扩增的中胚层细胞，而不从多能干细胞形成胚状体。随后通过与bFGF和任选的ROCK抑制剂和/或WNT途径激活剂接触，具有永久HE潜能的中胚层细胞被分化成永久HE细胞，其在分化过程中也被扩增。
[0014]本文提供的用于获得造血谱系细胞的方法优于EB介导的多能干细胞分化，因为EB的形成导致中等至最小的细胞扩增，不允许对需要均匀扩增的许多应用是重要的的单层培养以及细胞在群体中的均一分化，并且是费力和低效率的。
[0015]本文提供了利于分化为永久造血内皮的单层分化平台，导致造血干细胞和分化后代如T、B、NKT和NK细胞的衍生。所示单层分化策略将增强的分化效率与大规模扩增结合起来，可以递送治疗相关数量的多能干细胞来源的造血细胞用于各种治疗应用。此外，本专利技术公开了使用本文提供的方法的单层培养导致功能性造血谱系细胞，其能够进行全范围的体外分化，离体调节和体内长期造血自我更新、重建和移植。
[0016]本专利技术的一个方面提供了用于获得多能干细胞来源的造血细胞系的培养平台，其包含：第I组：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及一种或多种选自VEGF、SCF、Flt3L、IL15、IL3、IL6、IGF和TPO的生长因子和细胞因子，其中该培养基可选的不含Wnt途径激活剂和TGFβ受体/ALK抑制剂，并适于从永久造血内皮分化和扩增永久HSC；(ii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂以及可选的TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增永久造血内皮；以及(iii)培养基，其包含GSK3抑制剂、BMP激活剂，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增中胚层细胞。
[0017]可替代的，用于获得多能干细胞来源的造血细胞系的培养平台包含第II组：(i)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因
子，且可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂，其中该培养基适于从中胚层细胞分化和扩增具有永久本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于获得多能干细胞来源的造血细胞系而不产生拟胚体的培养平台，所述培养平台包含：(i)培养基，其包含ROCK抑制剂以及bFGF，其中所述培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂且其中所述培养基适于从多能干细胞来源的具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞分化和扩增多能干细胞来源的永久造血内皮；(ii)培养基，其包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，其中所述培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂且其中该培养基适于在多能干细胞来源的中胚层细胞中获得永久造血内皮潜能；和(iii)培养基，其包含BMP激活剂，以及可选的bFGF，其中该培养基适于从多能干细胞分化和扩增多能干细胞来源的中胚层细胞。2.如权利要求1所述的培养平台，其还包括：(iv)培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，其中该培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂且其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。3.如权利要求1所述的培养平台，其还包括：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种且其中该培养基适于将多能干细胞来源的前
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T祖细胞分化为多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞；或(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为多能干细胞来源的前
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T祖细胞；以及其中培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。4.如权利要求1所述的培养平台，其还包括：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种并适于将多能干细胞来源的前
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NK祖细胞分化为多能干细胞来源的NK祖细胞或NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为前
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NK祖细胞；且其中培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。5.如权利要求1所述的培养平台，其还包括：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含ROCK抑制剂且其中该培养基适于将多能干细胞来源的前
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HSC分化为多能干细胞来源的专能祖细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为多能干细胞来源的前
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HSC；以及其中培养基适于产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞。6.如权利要求1所述的培养平台，其中所述多能干细胞是iPSC或初始iPSC。7.一种用于获得和扩增多能干细胞来源的造血细胞而不产生拟胚体的平台，所述平台
包含：(i)培养基，其包含(a)ROCK抑制剂以及bFGF，且培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂；和(b)具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞，其中该培养基适于从具有永久造血内皮潜能的多能干细胞来源的中胚层细胞获得多能干细胞来源的永久造血内皮；(ii)培养基，其包含(a)BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂，其中该培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂；和(b)多能干细胞来源的中胚层细胞，其中该培养基适于从多能干细胞来源的中胚层细胞获得多能干细胞来源的具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞；和(iii)培养基，其包含(a)BMP激活剂，以及可选的bFGF；以及(b)多能干细胞，其中该培养基适于从多能干细胞获得多能干细胞来源的中胚层细胞。8.如权利要求7所述的平台，其还包括：培养基，其包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂，其中该培养基不含TGFβ受体/ALK抑制剂；以及多能干细胞，其中该培养基适于接种和扩增多能干细胞。9.如权利要求7所述的平台，其还包括：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以及多能干细胞来源的前
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T祖细胞，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前
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T祖细胞分化为多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞；或(ii)培养基，其包含ROCK抑制剂，一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子；以及多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为多能干细胞来源的前
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T祖细胞；且其中培养基适于产生多能干细胞来源的T细胞系。10.如权利要求7所述的平台，其还包括：(i)培养基，其包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；以及多能干细胞来源的前
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NK祖细胞，其中该培养基适于将多能干细胞来源的前
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NK祖细胞分化为多能干细胞来源的NK祖细胞或NK细胞；或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子，以及多能干细胞来源的永久造血内皮，其中该培养基适于将多能干细胞来源的永久造血内皮分化为前
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NK祖细胞；以及其中培养基适于产生多能干细胞来源的NK细胞系。11.如权利要求7所述的平台，其还包括一种或多种培养基，用于产生多能干细胞来源的造血专能祖细胞，其中培养基包含：(i)培养基，其包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子，其中该培养基不含ROCK抑制剂；以及多能干细胞来源的前
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HSC，其中培养基适于获得多能干细胞来源的前
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HSC至多能干细胞来源的专能祖细胞；和/或(ii)培养基，其包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子；以及多能干细胞来源的永久造血内皮，其中培养基适于获得多能干细胞来源的永久造血内皮至多能干细胞来源的前
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HSC。
12.如权利要求7所述的平台，其中所述多能干细胞是iPSC或初始iPSC。13.一种用于引导多能干细胞向造血谱系细胞分化的方法，包括：(i)使多能干细胞接触包含BMP激活剂和bFGF的组合物，以获得中胚层细胞；(ii)使中胚层细胞接触包含GSK3抑制剂、BMP激活剂和bFGF的组合物，以获得以获得具有永久造血内皮(HE)潜能的中胚层细胞；以及(iii)使具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含bFGF、ROCK抑制剂，以及选自VEGF、SCF、IL6和IL11中的一种或多种的的组合物，以获得永久HE细胞。14.如权利要求13所述的方法，其中(a)引导多能干细胞向造血谱系细胞的分化是：(i)不产生拟胚体；(ii)在单层培养下；(iii)在无饲养条件下；(iv)在无基质条件下；或(b)多能干细胞是iPSC或初始iPSC。15.一种用于产生多能干细胞来源的T细胞系的方法，包括：使多能干细胞来源的前
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T祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的T祖细胞或T细胞，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；其中多能干细胞来源的前
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T祖细胞获得自使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自SCF、Flt3L和IL7的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增；其中多能干细胞来源的永久造血内皮获得自使多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增；其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；其中多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞获得自使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物以允许细胞分化和扩增，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂，且其中多能干细胞来源的中胚层细胞获得自使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以允许细胞分化和扩增。16.如权利要求15所述的方法，(a)其中该方法进一步包括：使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；或(b)其中产生多能干细胞来源的T细胞系是(i)不产生拟胚体；(ii)在单层培养下；(iii)在无饲养条件下；或(iv)在无基质条件下；或(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。17.一种用于产生多能干细胞来源的NK细胞系的方法，包括：使多能干细胞来源的前
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NK祖细胞接触包含一种或多种选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的NK祖细胞或NK细胞，其中组合物不含VEGF、bFGF、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种；其中多能干细胞来源的前
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NK祖细胞获得自使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增；其中多能干细胞来源的永久造血内皮获得自使多能干细胞来源的具有永久HE潜能的
中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增，其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂；其中多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞获得自使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物，以允许细胞分化和扩增，其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂；且其中多能干细胞来源的中胚层细胞获得自使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以允许细胞分化和扩增。18.如权利要求17所述的方法，(a)其中该方法进一步包括：(i)使接种的多能干细胞、多能干细胞来源的中胚层细胞、具有造血内皮潜能的中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下；或(ii)使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；或(b)其中产生多能干细胞来源的NK细胞系是(i)不产生拟胚体；(ii)在单层培养下；(iii)在无饲养条件下；或(iv)在无基质条件下；或(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。19.一种用于产生多能干细胞来源的永久造血内皮的方法，包括：使多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的永久造血内皮，其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂；其中多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞获得自使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物，以允许细胞分化和扩增，其中组合物可选的不含TGFβ受体/ALK抑制剂；且其中多能干细胞来源的中胚层细胞获得自使多能干细胞接触包含BMP激活剂以及可选的bFGF的组合物，以允许细胞分化和扩增。20.如权利要求19所述的方法，(a)，其中该方法进一步包括以下之一或两者：(i)使多能干细胞接触包含MEK抑制剂、GSK3抑制剂和ROCK抑制剂的组合物，以接种和扩增多能干细胞，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；(ii)使接种的多能干细胞、多能干细胞来源的中胚层细胞、具有永久造血内皮潜能的中胚层细胞和/或永久造血内皮处于约2％至约10％的低氧张力下；或(b)其中产生多能干细胞来源的永久造血内皮是(i)不产生拟胚体；(ii)在单层培养下；(iii)在无饲养条件下；或(iv)在无基质条件下；或(c)其中多能干细胞是iPSC或初始iPSC。21.一种用于产生多能干细胞来源的专能造血谱系祖细胞的方法，包括：使多能干细胞来源的前
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HSC接触包含BMP激活剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以获得多能干细胞来源的专能祖细胞，其中组合物不含ROCK抑制剂；其中多能干细胞来源的前
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HSC获得自使多能干细胞来源的永久造血内皮接触包含BMP激活剂、ROCK抑制剂，以及一种或多种选自TPO、IL3、GMCSF、EPO、bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增；
其中多能干细胞来源的永久造血内皮获得自使多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞接触包含ROCK抑制剂，以及一种或多种选自bFGF、VEGF、SCF、IL6和IL11的生长因子和细胞因子的组合物，以允许细胞分化和扩增，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；其中多能干细胞来源的具有永久HE潜能的中胚层细胞获得自使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑制剂的组合物，以允许细胞分化和扩增，其中组合物不含TGFβ受体/ALK抑制剂；其中多能干细胞来源的中胚层细胞获得自使多能干细胞来源的中胚层细胞接触包含BMP激活剂、bFGF和GSK3抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴莱姆，
申请(专利权)人：菲特治疗公司，
类型：发明
国别省市：