miR-126a-5p在CD4制造技术

本发明专利技术属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及miR

【技术实现步骤摘要】
miR
‑
126a
‑
5p在CD4
+
T细胞分化中的应用

：
[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及miR
‑
126a
‑
5p在CD4
+
T细胞分化的应用。

技术介绍
：
[0002]包虫病，又叫棘球蚴病，是一种由棘球绦虫引起的严重的人畜共患寄生虫病。作为全球的公共卫生问题，严重影响社会经济的发展和患者身体健康。在包虫病的研究过程中，已制备出了对羊，鼠有很高免疫保护力(90％以上)的重组蛋白P29。在包虫感染的早期，Th1细胞活化增殖功能明显增强，激活细胞免疫应答，具有控制包虫早期形成、生长、转移及抗感染的作用；在感染的中晚期，主要以Th2型细胞活化为主，包虫产生免疫耐受，有利于包虫病原体的寄生。而重组蛋白P29能够促进小鼠CD4
+
T细胞朝Th1方向分化，保护机体免受病原体的感染。
[0003]miRNA是真核生物内广泛表达的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码小RNA分子，主要通过与其靶基因mRNA的3
′
非翻译区(UTR)发生特异性的相互结合降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA的翻译，从而阻断靶基因蛋白质的形成。随着生命科学研究的发展，关于miRNA在寄生虫感染过程中的作用受到研究者广泛关注，多项研究表明miRNA参与宿主感染进程、免疫反应、寄生虫耐药性和免疫逃逸等多个进程。
[0004]DLK1(Delta样同源物1)蛋白是一个包含六个表皮生长因子重复的跨膜蛋白，属于表皮生长因子家族成员，在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用。

技术实现思路
：
[0005]本专利技术在前期研究中，通过高通量测序技术，鉴定包虫感染以及重组蛋白P29免疫不同不同时间的脾脏CD4
+
T细胞miRNA表达谱，发现miR
‑
126a
‑
5p呈显著差异上调表达，推测其可能在CD4
+
T细胞中发挥重要调控作用。本专利技术通过生物信息学网站预测了miR
‑
126a
‑
5p的靶基因DLK1，并通过实验验证miR
‑
126a
‑
5p通过调节DLK1进而影响CD4
+
T细胞的分化。由于实验涉及到脾脏细胞，人体实验无法进行，因此本专利技术在小鼠脾脏细胞中验证。miR
‑
126a
‑
5p的成熟体序列在鼠和人体中是一致的，为临床探讨包虫感染病人体内免疫机制的变化提供了新的思路和方向。
[0006]本专利技术提供的技术方案之一，是miR
‑
126a
‑
5p在促进CD4
+
T细胞朝Th1方向分化中的应用。所述miR
‑
126a
‑
5p的核苷酸序列为CAUUAUUACUUUUGGUACGCG。
[0007]本专利技术通过TargetScan、miRWalk、miRTarbase 3个信息学软件预测miR
‑
126a
‑
5p的靶基因，并通过TargetScan网站发现DLK1的3
′
UTR中含有miR
‑
126a
‑
5p序列的结合位点，将DLK1野生型(wt)3
′
UTR和含有预测结合位点的序列突变的3
′
UTR构建到psiCHECK
‑
2中，通过双荧光素酶报告分析，发现DLK1野生型3
′
UTR区受到miR
‑
126a
‑
5p的调控，而突变型不受miR
‑
126a
‑
5p调控。还利用qRT
‑
PCR和Western blotting在转录和翻译水平验证miR
‑
126a
‑
5p对DLK1的调控作用，发现miR
‑
126a
‑
5p在转录和翻译水平下调DLK1的表达。至此，可以确
定，miR
‑
126a
‑
5p与DLK1的靶向关系，即miR
‑
126a
‑
5p能够与DLK1的3
′
UTR发生特异性结合，阻断DLK1蛋白质的合成。
[0008]鉴于DLK1在多种细胞的增殖及转分化中起重要作用，为了进一步确定miR
‑
126a
‑
5p与CD4
+
T细胞分化的关系，本专利技术在向CD4
+
T细胞中转染miR
‑
126a
‑
5p模拟物和miR
‑
126a
‑
5p抑制物后，检测CD4
+
T细胞的分化情况，具体如下：
[0009]利用qRT
‑
PCR技术，检测miR
‑
126a
‑
5p介导的CD4
+
T细胞的分化，发现转染miR
‑
126a
‑
5p mimics后，促进Th1型细胞代表因子IFN
‑
γ的表达，并抑制Th2型细胞代表因子IL
‑
4的表达；转染miR
‑
126a
‑
5p inhibitor后，抑制Th1型细胞代表因子IFN
‑
γ的表达，并促进Th2型细胞代表因子IL
‑
4的表达。
[0010]利用流式细胞术检测IFN
‑
γ、IL
‑
4的蛋白表达情况，结果显示转染miR
‑
126a
‑
5p mimics后，促进Th1型细胞代表因子IFN
‑
γ的表达，并抑制Th2型细胞代表因子IL
‑
4的表达；转染miR
‑
126a
‑
5p inhibitor后，抑制Th1型细胞代表因子IFN
‑
γ的表达，并促进Th2型细胞代表因子IL
‑
4的表达。
[0011]至此，可以确定，miR
‑
126a
‑
5p能够调节CD4
+
T的分化，且促进其向Th1方向分化，抑制其向Th2方向分化。
[0012]为了验证靶基因DLK1对CD4
+
T细胞分化的影响，本专利技术还合成了靶基因DLK1干扰小片段siRNA
‑
DLK1
‑
523(5
′‑
GGAGAAAGGCCAGUACGAATTUUCGUACUGGCCUUUCUCCTT
‑3′...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.miR
‑
126a
‑
5p在促进CD4
+
T细胞朝Th1方向分化中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特在在于，所述miR
‑
126a
‑
5p的核苷酸序列为CAUUAUUACUUUUGGUACGCG。3.miR
‑
126a
‑
5p模拟物在制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱明星，杜先才，徐士梅，赵殷奇，杨继辉，杨慧，赵巍，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：