一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞。本发明专利技术公开了上述免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：将外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，加入细胞因子IFN

【技术实现步骤摘要】
一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及免疫细胞
，尤其涉及一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是严重威胁人类健康的常见病、多发病。在我国每年的恶性肿瘤患者超过160万人，癌症正超过心血管疾病成为第一位致死原因，肿瘤的生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四大治疗方法，由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到预防肿瘤的预防上。
[0003]如果能够停止、减少、甚至预防不断增加的癌症发病率，那么就可以避免使用一些昂贵的治疗方案和强烈的治疗药物，对全世界的癌症患者和医疗保健机构都是有益的，因此无论是从癌症患者的角度出发，还是对承受巨大经济压力的医疗保健机构来说，癌症化学预防的理念是非常必要的。
[0004]免疫细胞是肿瘤免疫中的核心成分，免疫细胞主要包括淋巴细胞、抗原提呈细胞、造血干细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及嗜碱性粒细胞等。在肿瘤国际免疫治疗中，先后经历了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、抗CD3单克隆抗体诱导的杀伤性细胞及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)，由于一些细胞免疫治疗因其效应细胞来源困难(如TIL)或治疗副反应较大(如LAK)等原因，故目前研究和报道越来越少。
[0005]CN 102321577 B公开一种抗肿瘤过继免疫细胞制备方法及制得的免疫细胞，所述方法包括采集分离外周血单个核细胞，添加细胞因子诱导培养得到杀伤细胞CIK，所述细胞因子包括CD28McAb，制备的免疫细胞能够使效应细胞扩张倍数增强、杀伤性细胞毒活性增强，虽然得到的DC
‑
CIK成为肿瘤特异性细胞性杀伤性细胞，提高CIK群体的整体杀瘤效果，但其并未公开对于预防肿瘤发生的效果。
[0006]专利技术人通过将其应用于预防肿瘤发生，发现其效果并不明显，目前如果制备一种免疫细胞，达到预防肿瘤发生的效果，具有极好的研究前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞及其制备方法与应用。
[0008]一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1、将外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，加入细胞因子IFN
‑
γ500
‑
2000μg/ml进行培养；
[0010]S2、培养至第2日，加入细胞因子CD3McAb 0.5
‑
5μg/mL、CD28McAb 0.5
‑
2μg/mL、IL
‑
2 500
‑
2000μg/mL继续培养；
[0011]S3、培养至第7日，加入细胞因子CD
‑
40L 0.1
‑
0.5μg/mL、GM
‑
CSF 0.1
‑
0.5μg/mL，继续培养；
[0012]S3、培养过程每3
‑
4天补充培养基，每1
‑
2天补充细胞因子IL
‑
2 500
‑
2000μg/mL，连续培养至14天，细胞成熟。
[0013]GM
‑
CSF为粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子，兴奋骨髓的造血功能、刺激粒细胞、单核细胞、T细胞的增殖，并能促进单核细胞和粒细胞的成熟，增强单核细胞、粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞功能，能提高机体抗肿瘤及抗感染免疫力。
[0014]优选地，S1的培养过程中，控制细胞密度为1
‑5×
107/mL。
[0015]优选地，S2的培养过程中，控制细胞密度为1
‑5×
107/mL。
[0016]优选地，S2的培养过程中，培养温度为37
±
0.5℃，二氧化碳浓度为5
±
0.2％。
[0017]优选地，外周血单个核细胞采用如下步骤制取：无菌抽取外周血，加入放有肝素盐水的离心管，轻摇，充分抗凝，用生理盐水按1：1稀释，加入至淋巴细胞分离液中，室温离心10
‑
15min，吸出外周血单个核细胞。
[0018]优选地，离心速度为1500
‑
3000r/min。
[0019]优选地，吸出外周血单个核细胞后移入新的离心管中，加生理盐水，用吸管轻吹混合，离心10
‑
15min，弃去上清液，加入培养基培养。
[0020]优选地，培养基为GIBCO AIM
‑
V无血清培养基，加入培养基调节细胞密度为1
‑5×
107个/mL，培养温度为37
±
0.5℃，二氧化碳浓度为5
±
0.2％。
[0021]一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞，采用上述可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法制得。
[0022]上述可以预防肿瘤发生的免疫细胞在制备预防乳腺癌细胞生长或转移药物中的应用。
[0023]本专利技术的技术效果如下所示：
[0024](1)本专利技术在CIK诱导体系中，在引入细胞因子CD28McAb，虽然可提高诱导效果，提高细胞增殖倍数，具有较好的杀瘤效果，但是预防效果差；本专利技术在第七日添加CD
‑
40L与GM
‑
CSF刺激因子，不仅可有效刺激T细胞增殖，可有效增强抗肿瘤的免疫反应，诱导肿瘤衰退，对肿瘤的预防效果极好；
[0025](2)专利技术人经过大量实验发现，将CD28McAb与CD
‑
40L、GM
‑
CSF刺激因子的共同刺激配合，可诱导其预防肿瘤的能力，这是单独添加CD28McAb刺激因子所不具备的，将本专利技术制备的免疫细胞注入十只鼠后，180d大鼠存活率达到90％，而仅仅采用CD28McAb的免疫细胞，无一例外在60天内发生肿瘤而死亡。
附图说明
[0026]图1为实施例3中试验组与空白组大鼠的肿瘤体积随时间的变化图。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步解说。
[0028]实施例1
[0029]从温州医科大学实验动物中心购买的SD大白鼠饲养于动物房SPF环境下，使其随意获取饲料和水，适应环境1周。动物实验的所有原则和程序均符合《实验动物管理条例》的相关规定。
[0030]将大鼠进行编号，然后无菌条件下依次抽取大鼠外周血，加入放有肝素盐水的离心管，轻摇，充分抗凝，用生理盐水按1：1稀释，加入至淋巴细胞分离液上，2000r/min室温离心15min，吸出PBMC并移入新的离心管中，加生理盐水，用吸管轻吹混合，2000r/min离心15min，弃去上清液，加入AIM
‑
V(GIBCO)无血清培养基调节细胞密度1
‑5×
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将外周血单个核细胞与培养基一起置于包被有Retronectin的培养瓶中，加入细胞因子IFN
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γ500
‑
2000μg/ml进行培养；S2、培养至第2日，加入细胞因子CD3McAb 0.5
‑
5μg/mL、CD28McAb 0.5
‑
2μg/mL、IL
‑
2500
‑
2000μg/mL继续培养；S3、培养至第7日，加入细胞因子CD
‑
40L 0.1
‑
0.5μg/mL、GM
‑
CSF0.1
‑
0.5μg/mL，继续培养；S4、培养过程每3
‑
4天补充培养基，每1
‑
2天补充细胞因子IL
‑
2500
‑
2000μg/mL，连续培养至14天，细胞成熟。2.根据权利要求1所述可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法，其特征在于，S1的培养过程中，控制细胞密度为1
‑5×
107/mL。3.根据权利要求1所述可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法，其特征在于，S2的培养过程中，控制细胞密度为1
‑5×
107/mL。4.根据权利要求1所述可以预防肿瘤发生的免疫细胞的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：ꢀ七四专利代理机构，
申请(专利权)人：杭州中赢生物医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：