一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用，涉及生物医学领域。本发明专利技术将Tet

【技术实现步骤摘要】
一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]合适的肝细胞系在生物人工肝技术、药理毒理学研究和肝脏组织工程研究中的地位越来越重要。理想的肝细胞源应具备完整的肝功能、良好的增殖能力以及无致瘤、无感染的风险。目前常用的肝细胞源有原代人肝细胞、原代猪肝细胞、人肝癌细胞系HepG2、HepaRG、永生化细胞以及干细胞分化肝细胞等。这些类肝细胞在体外虽然具有一定的肝功能，但是它们各自存在着成熟度不足、有限性扩增、功能不稳定、异种移植排斥、生物安全性不高和致瘤风险等应用障碍。
[0003]公开号为CN110438157B和公开号为CN105521482A的中国专利技术专利申请公开了，单独或联合应用不同的肝细胞特异性转录因子来进一步诱导类肝细胞分化的方法，但这些方法或种子细胞来源于肝癌细胞，或使用的培养体系成本高昂，皆难以进行临床转化。
[0004]公开号为CN105925609B和公开号为CN107557389A的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备肝功能可逆的永生化肝细胞的方法，其特征在于，将包装后的含调控肝细胞转录的Tet
‑
on系统的慢病毒感染人永生化肝细胞然后利用筛选剂和扩增培养基对经病毒转染后的细胞进行抗性筛选和扩增传代培养，得到肝功能可逆的永生化肝细胞系；通过添加四环素类似物使得永生化肝细胞系呈肝向功能强化状态，通过去除四环素类似物使得永生化肝细胞系呈正常肝细胞增殖状态；所述调控肝细胞转录的Tet
‑
on系统包括调节表达盒和反应表达盒，所述调节表达盒包括肝脏特异性启动子和反义四环素激活子，所述反应表达盒包括四环素诱导型启动子和转录因子编码基因；所述转录因子编码基因包括FOXA3基因、CEBPA基因和GATA6基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人永生化肝细胞是由人永生化肝细胞系作为基底种子细胞；在进行慢病毒感染前进行基底种子细胞的培养准备，所述基底种子细胞的培养准备包括：将人永生化肝细胞进行培养，以得到汇合率为50%
‑
70%的基底种子细胞；所述四环素类似物为金霉素、土霉素、米诺环素、多西环素或强力霉素。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包装后的慢病毒与人永生化肝细胞的混合比例为：每5
×
105数量的人永生化肝细胞与1
×
107‑
2.5
×
107数量的包装后的慢病毒液混合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，感染人永生化肝细胞48
‑
72h后，换用含有筛选剂的培养基继续再传代培养；所述再传代培养的代数为3
‑
4代。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述筛选剂为嘌呤霉素、腐草霉素、杀稻瘟菌素、潮霉素或新霉素。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节表达盒还包括和第一筛选基因、转录后调控元件和衔接元件，且所述肝脏特异性启动子、所述反义四环素激活子、衔接元件、第一筛选基因和转录后调控元件沿5
’‑3’
方向依次串联；所述肝脏特异性启动子选自CMV启动子、PGK启动子、白蛋白启动子、载脂蛋白E启动子、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子、α
‑
I
‑
抗胰蛋白酶启动子、甲状腺激素结合球蛋白启动子、α
‑
甲胎蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，曾敏，晏正明，韩旭，翁骏，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：