转录调控因子WalR和MgrA的亚硝基化修饰在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用制造技术

本发明专利技术通过蛋白质组学联合质谱鉴定发现金黄色葡萄球菌内源产生的一氧化氮可以引起自身蛋白质的亚硝基化修饰。实验证明重要转录调控因子WalR和MgrA的亚硝基化修饰有潜力成为万古霉素耐药治疗的靶点。为万古霉素耐药治疗的靶点。

【技术实现步骤摘要】
转录调控因子WalR和MgrA的亚硝基化修饰在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及转录调控因子WalR和MgrA 的亚硝基化修饰在治疗金黄色葡萄球菌感染中的应用，可以为临床金黄色葡萄球耐药菌的治疗提供新的靶点。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类主要的机会性细菌病原体，自然界中广泛存在，其感染可能引发肺炎、心内膜炎、骨髓炎，甚至脓毒血症等多种严重疾病。金黄色葡萄球菌的感染治疗主要依赖抗生素，然而抗生素的使用以及滥用催生并富集了耐药性菌株，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin
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resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在医院和社区的广泛感染与传播已成为最难解决的感染性问题。多年来，MRSA 菌株多重耐药性的报道也屡见不鲜。万古霉素作为临床上治疗MRSA感染的最后一道防线，其中度抗性(vancomycin
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intermediate Staphylococcusaureus，VISA)及抗性菌株(vancomycin
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resistant Staphylococcus aureus， VRSA)的出现，为金黄色葡萄球菌的感染治疗提出了巨大挑战。因此寻找新型抗菌药物的靶标对开发新药物具有至关重要的作用。
[0003]在环境与宿主体内的长期进化过程中，金黄色葡萄球菌发展出了非常灵敏完善的环境刺激应答机制，其致病性和耐药性发生、特异性基因表达、与宿主相互作用等行为受到细菌胞内一系列调控体系和复杂网络的严密调控。例如气体信号分子(gasotransmitters)就是其中一种典型的重要调控单元。目前被广泛研究和报道的气体信号分子主要有三种：一氧化氮 (NO)，一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)。
[0004]其中NO是一种双原子亲脂性气体分子，在细胞内以自由基的形式存在，可自由透过细胞膜，高浓度下具有细胞毒性，低浓度时具有信号转导和生理调控功能。NO作为信号分子首先在真核生物中被发现，可由一氧化氮合成酶(nitric oxide synthases，NOS)内源产生，参与调节各种生理及免疫功能。不仅如此，NO在细菌体内也发挥着重要作用。一方面，外源高浓度NO(宿主来源或NO供体)对细菌具有杀伤作用；另一方面，细菌在应对宿主高浓度NO压力时，不仅进化出一系列NO感应和防御机制，有的自身也能产生少量NO，尤其在某些革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌中也存在可以催化产生NO的一氧化氮合成酶。低浓度NO反而对细菌具有重要的生理调控作用，如保护细胞抵抗氧化压力以及提高细菌的耐药性和致病性等。
[0005]NO作为生物活性分子，能对蛋白质半胱氨酸残基的巯基进行亚硝基化修饰产生亚硝基化硫醇SNO，进而影响蛋白质的活性和功能。目前还没有关于细菌内源NO对自身蛋白组进行修饰的报道，因此我们利用蛋白质修饰组学的方法鉴定了金黄色葡萄球菌中可被其内源NO亚硝基化修饰的蛋白质靶点，希望能为金黄色葡萄球菌VISA感染以及其他细菌病原体的感染治疗提供新的靶标和策略。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过蛋白质组学联合质谱鉴定发现金黄色葡萄球菌内源产生的一氧化氮可以引起自身蛋白质的亚硝基化修饰。实验证明重要转录调控因子WalR和MgrA的亚硝基化修饰有潜力成为万古霉素耐药治疗的靶点。
[0007]本专利技术首先构建了nos敲除菌株，以抑制蛋白质半胱氨酸位点发生亚硝基化修饰，然后利用iodoTMT(irreversible isobaric iodoacetyl Cys
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reactivetandem mass tag)对野生型菌株中发生SNO亚硝基化修饰的蛋白质进行同位素标记并富集，然后结合基于质谱的蛋白质组学方法分析，并将nos敲除菌株与野生型菌株进行对比，以鉴定金黄色葡萄球菌中可被细菌内源 NO亚硝基化修饰的蛋白质靶点。根据蛋白质修饰组学的鉴定结果，选择了两个金黄色葡萄球菌的重要全局调控因子WalR和MgrA作为研究对象。 WalR属于二元信号系统WalK/WalR的应答调节蛋白，对自溶、细胞壁代谢、生物被膜形成等生理过程具有重要调控作用。WalR蛋白共含有C33 和C67两个半胱氨酸残基，均在信号接收结构域(receiver domain)上，其中C67被质谱鉴定可被NO修饰；MgrA蛋白也是金黄色葡萄球菌中一个重要的全局调控因子，只含有C12位的一个半胱氨酸，且被质谱鉴定可被NO修饰(图1)。本专利技术构建了被鉴定修饰位点半胱氨酸残基的单点突变菌株，并研究了其对万古霉素敏感性的变化。结果表明，WalR中的亚硝基化修饰位点C67和MgrA中的亚硝基化修饰位点C12在发生突变后，无法被亚硝基化，导致金黄色葡萄球菌的耐药性下降，可以作为万古霉素耐药治疗的靶点。
[0008]在此基础上，一方面，本专利技术提出了WalR的亚硝基化修饰和/或MgrA 的亚硝基化修饰作为靶点在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。
[0009]另一方面，本专利技术提出了将WalR的亚硝基化修饰位点和/或MgrA的亚硝基化修饰位点的半胱氨酸修饰为不含巯基的氨基酸的试剂在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的应用。
[0010]在一些实施方案中，所述WalR的亚硝基化修饰位点为C67，所述 MgrA的亚硝基化修饰位点为C12。
[0011]另一方面，本专利技术提出了对WalR蛋白的亚硝基化修饰位点和/或MgrA 蛋白的亚硝基化修饰位点进行修饰以防止亚硝基化修饰的试剂在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的应用。
[0012]在一些实施方案中，所述WalR蛋白的亚硝基化修饰位点为C67，所述MgrA蛋白的亚硝基化修饰位点为C12。
[0013]又一方面，本专利技术提出了一种治疗金黄色葡萄球菌感染的药物组合物或试剂盒，包括突变诱导剂和抗生素，所述突变诱导剂能够将WalR的亚硝基化修饰位点和/或MgrA的亚硝基化修饰位点的半胱氨酸修饰为不含巯基的氨基酸。
[0014]在一些实施方案中，所述WalR的亚硝基化修饰位点为C67，所述 MgrA的亚硝基化修饰位点为C12。
[0015]又一方面，本专利技术提出了一种治疗金黄色葡萄球菌感染的药物组合物或试剂盒，包括亚硝基化抑制剂和抗生素，所述亚硝基化抑制剂能够对 WalR蛋白的亚硝基化修饰位点和/或MgrA蛋白的亚硝基化修饰位点进行修饰以防止亚硝基化修饰。
[0016]在一些实施方案中，所述WalR蛋白的亚硝基化修饰位点为C67，所述MgrA蛋白的亚
硝基化修饰位点为C12。
[0017]在一些实施方案中，所述抗生素为万古霉素。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]NO作为信号分子发挥调控功能的分子机制主要在真核生物中被广泛研究和报道；而在细菌中，其内源产生的NO也被报道可以影响细菌的环境适应性、压力应答、抗性、毒力等多种细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.WalR的亚硝基化修饰和/或MgrA的亚硝基化修饰作为靶点在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物中的应用。2.将WalR的亚硝基化修饰位点和/或MgrA的亚硝基化修饰位点的半胱氨酸修饰为不含巯基的氨基酸的试剂在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述WalR的亚硝基化修饰位点为C67，所述MgrA的亚硝基化修饰位点为C12。4.对WalR蛋白的亚硝基化修饰位点和/或MgrA蛋白的亚硝基化修饰位点进行修饰以防止亚硝基化修饰的试剂在制备治疗金黄色葡萄球菌感染的药物或试剂盒中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述WalR蛋白的亚硝基化修饰位点为C67，所述MgrA蛋白的亚硝基化修饰位点为C12。6.一种治疗金黄色葡萄球菌感染的药物组合物或试剂盒，包括突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宝林，舒雪琴，黄奕，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：