【技术实现步骤摘要】
一种微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法
[0001]本专利技术属于蛋白质组学研究方向药物靶蛋白筛选方法领域,具体涉及通过微球辅助的蛋白质加热沉淀来筛选药物靶蛋白,与药物小分子发生结合的靶蛋白的热稳定性增强、不易因热沉淀而沉积到微球表面,从而能将药物靶蛋白从复杂的背景蛋白质组中区分出来。该方法操作简便快速、高通量高灵敏度、可以在次微克级别样品中进行药物靶蛋白筛选。
技术介绍
[0002]近年来,随着蛋白质组学技术的发展,基于表型筛选的方法重新在新药研发领域展现出优势(文献1:Lee,J.&Bogyo,M.Target deconvolution techniques in modern phenotypic profiling.Current Opinion in Chemical Biology 17,118-126,doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.022(2013).;文献2:Wagner,B.K.The resurgence of phenotypic screening in drug discovery and development.Expert Opinion on Drug Discovery 11,121-125,doi:10.1517/17460441.2016.1122589(2016).)。即使是在基于靶点的药物发现模式占主流的21世纪早期,表型筛选仍然比基于靶点的筛选方法发现了更多的一线小分子药物(文献3:Swinney,D.C.&am ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种微球辅助的基于蛋白加热沉淀的药物靶蛋白筛选方法,其特征在于:1)对蛋白提取物样品分别进行加药处理(加入待筛选靶蛋白的、待研究药物)和空白处理(不加药的处理),于两种处理的样品组中分别加入微球材料,再对两种处理的样品分别都进行加热处理,使样品中蛋白因加热变性而沉淀;2)将样品中的微球材料取出,对加药组和空白组中的蛋白丰度进行定量分析;通过加药组与空白组之间的蛋白定量差异可以筛选出小分子药物的靶蛋白;靶蛋白为空白组微球材料上的沉淀中丰度(沉淀量)大于加药组沉淀中丰度的蛋白。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:1)生物样本在保持蛋白活性结构的条件下进行蛋白提取,测定提取液中的蛋白浓度,并调节蛋白浓度至0.5-2mg/mL;2)使用分散溶剂溶解待研究的小分子药物,小分子药物终浓度1-10mM;将待分析的蛋白提取液等分为两份,一份加入待研究的药物(溶于分散溶剂的药物)、另一份加入与加入药物等体积的空白分散溶剂,然后孵育10~60分钟;加入的药物溶液或空白溶剂的体积比不超过蛋白提取液的10%,优选0.5-2%;3)于分别为20μL溶液的孵育完成的加药和空白组蛋白溶液中分别加入等量的微球材料,投料量10-100μg将样品进行加热处理,温度区间在30~80摄氏度之间,在加热处理下,蛋白从可溶状态转变为不可溶沉淀并且沉积到微球表面;此时,空白组微球材料上的药物靶蛋白沉淀量大于加药组;4)分别将加药组和空白组中表面有蛋白沉积的微球与含有未变性的可溶性蛋白的溶液分离,直接在微球表面上对通过微球辅助捕捉到蛋白沉淀进行烷基化、酶解等蛋白质组样品前处理,通过基于质谱的高通量定量蛋白质组学技术,对加药组和空白组中的蛋白丰度进行定量分析;通过比较沉淀样品中,加药组与空白组之间的蛋白质丰度差异,能够从广泛的背景蛋白中鉴定到待研究药物的靶蛋白;或者,对于已知的需要验证的蛋白可以使用蛋白质免疫印迹方法(Western Blotting),利用感兴趣蛋白的抗体进行蛋白质定量,通过比较加药组与空白组之间的蛋白质丰度差异,从而得知此蛋白是否为待研究药物的靶点。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:在保持蛋白活性结构的条件下进行蛋白提取的方法为液氮研磨组织、冻融破碎细胞等中的一种或二种以上;所述的“保持蛋白活性结构的条件”,对于组织样品,可以采取液氮研磨的方式进行蛋白提取,将组织在0-4℃条件下剪碎后加入液氮进行研磨;对于细胞样品,可以采用快速冻融法破碎细胞提取蛋白,向10
4-107细胞样品中加入0-4℃预冷的0.2-1mL缓冲溶液并均匀分散细胞,将混合样品投入液氮快速冷冻1-5分钟,再投入25-37℃水浴融化1-5分钟,使得样品刚好从冰水混合物转变为完全融化状态,注意不要过度加热样品;无论经过何种蛋白提取方式,蛋白提取液需通过10000-25000g高速离心,除去不溶解的组织、细胞碎片,保留含有活性蛋白质的上清液。4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述的“测定提取液中蛋白浓度”,可使用Bradford法或其他蛋白浓度测定方法;
缓冲盐溶液为PBS、HEPES等不含有伯胺基团的缓冲盐溶液中的一种或二种以上蛋白质水解酶包括但不局限于胰蛋白酶、胃蛋白酶等中的一种或二种以上;所述的“孵育完成的蛋白溶液(加药或空白)”,指的是加入小分子药物溶液或空白溶剂后孵育一段时间的蛋白溶液,其所孵育时间取决于小分子药物与靶蛋白的亲和力,为了加速二者结合,孵育过程通常在20-25℃条件下进行,因此孵育时间通常不超过60分钟(优选30分钟)以防止溶液中蛋白质的结构和活性改变;所述的“微球材料”,指的是微米尺寸的球状材料(直径1-5μm),多种表面性质不同的微球材料都可以被应用到本方法中,包括但不局限于C-18微球、光滑的铁球、表面键合羧基的磁性微球等材料中的一种或二种以上;分散溶剂为水、二甲基亚砜、缓冲盐溶液、乙腈等剂中的一种或二种以上;微球与溶液分离的分离手段包括但不局限于离心、磁力分离等中的一种或二种以上。5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤3)将孵育完成的蛋白溶液(加药或空白)分别分为2份以上(优选5~10份)20μL溶液(每份对应蛋白质量10~40μg),分别加入等量的微球材料(投料量10-100μg);对于一个加热处理温度点的一对样品(加药和空白组各一个)...
【专利技术属性】
技术研发人员:叶明亮,吕佳纹,
申请(专利权)人:中国科学院大连化学物理研究所,
类型:发明
国别省市:
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