猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基、培养方法以及培养物的应用技术

本发明专利技术公开了一种猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基、培养方法以及培养物的应用，按重量百分比计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉1.8～2.5wt％、牛肉浸粉1.8～2.5wt％、蛋白胨1.8～2.5wt％、大豆蛋白胨0.9～1.2wt％、葡萄糖0.5～1wt％、氯化钠0.1～0.3wt％、磷酸氢二钾0.2～0.5wt％、乙酸铵0.2～0.5wt％、磷酸氢二钠0.1～0.3wt％、蔗糖0.5～1wt％、蔗糖酯0.3～0.5wt％，余量水。本发明专利技术改进猪丹毒弱毒菌的培养基组成，营养成分高，尤其适用于猪丹毒弱毒菌G4T10的培养，且培养基的组分中没有有毒成分，不需要离心去除，有助于提升疫苗产品的质量。量。

【技术实现步骤摘要】
猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基、培养方法以及培养物的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基、培养方法以及培养物的应用。

技术介绍

[0002]猪丹毒(Erysipelas suis)是一种由红斑丹毒丝菌俗称丹毒杆菌引起的传染病，在临床可分慢性、亚急性和急性，慢性型引发疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎，亚急性引起皮肤疹块，急性引起败血症，主要发病于3个月以上的生长猪。猪丹毒的流行无明显季节性，但夏季发生较多，冬春季只有散发。目前集约化养猪场由于环境条件较好所以相对比较少见，但仍未完全控制，本病成世界性分布，而一旦发病整个猪场将面临巨大经济损失。
[0003]猪丹毒活疫苗对预防猪丹毒病起到了重要的作用。大量稳定繁殖生长猪丹毒弱毒菌是制备高质量猪丹毒活疫苗的关键所在。目前，一般使用厌气肉肝汤、厌气肉肝胃酶消化汤培养培养猪丹毒弱毒菌。配制这种培养基工序多，耗费时间、人物力，需要购置大量牛肉，而市面上牛肉多是饲料喂养的肉牛，生长周期短，制备出的培养基营养成分不充足，使得发酵菌液活菌数少，冻干后产品头份不够或者出现安全性问题，而现有的肉肝胃干粉培养基中含有吐温
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80，有一定毒性，需要离心去除，否则会影响联苗的效价，而在离心过程中，容易造成污染，且费时费力，最终影响疫苗产品的质量。猪丹毒弱毒菌活疫苗的质量不仅与培养基成分和细菌菌株相关，还与培养时间、温度和pH值等培养的条件有关。所以，研究适合猪丹毒弱毒菌稳定良好繁殖生长的培养基及其培养方法具有极其重要的意义。

技术实现思路

[0004]针对上述猪丹毒弱毒菌培养基营养较差、具有毒性等问题，本专利技术提供了一种猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基、培养方法以及培养物的应用，该培养基无毒且能够促进猪丹毒弱毒菌高产活菌数。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基，按重量份计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉1.8～2.5wt％、牛肉浸粉1.8～2.5wt％、蛋白胨1.8～2.5wt％、大豆蛋白胨0.9～1.2wt％、葡萄糖0.5～1wt％、氯化钠0.1～0.3wt％、磷酸氢二钾0.2～0.5wt％、乙酸铵0.2～0.5wt％、磷酸氢二钠0.1～0.3wt％、蔗糖0.5～1wt％、蔗糖酯0.3～0.5wt％，余量水。
[0006]所述培养基的pH值为7.0～8.5，优选pH值为7.0～7.5。
[0007]本专利技术的培养基含有酵母浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠等商品化生物化学试剂，具有培养基组成成份获取方便，且其培养方法具有工艺简便、质量稳定、生产周期短、制造成本低等优点。
[0008]优选地，按重量份计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉2～2.3wt％、牛肉浸粉2～
2.3wt％、蛋白胨2～2.3wt％、大豆蛋白胨1～1.1wt％、葡萄糖0.6～0.8wt％、氯化钠0.15～0.25wt％、磷酸氢二钾0.3～0.4wt％、乙酸铵0.3～0.4wt％、磷酸氢二钠0.15～0.25wt％、蔗糖0.6～0.8wt％、蔗糖酯0.35～0.45wt％，余量水。
[0009]培养基采用如下方法制得：按照上述培养基组成称取所需量的组份，均匀混合后，加入适量的蒸馏水，充分溶解后，再加入蒸馏水定容，116℃灭菌30min，即得。
[0010]本专利技术第二方面提供一种猪丹毒弱毒菌G4T10的培养方法，该培养方法包括下述步骤：
[0011]S1、将猪丹毒弱毒菌G4T10接种于血平板上，在36～37℃下培养18～22h，制得猪丹毒弱毒菌G4T10的一级种子；
[0012]S2、挑选出圆形、细小、半透明、光滑、湿润、圆整的猪丹毒弱毒菌G4T10的一级种子单菌落接种于培养基中，在36～37℃下培养20～24h后，再按2～3v/v％接种于培养基中在36～37℃下培养20～24h；
[0013]S3、在发酵罐中按照70～75v/v％加入培养基，以培养基体积计，消泡剂加入0.01～0.02v/v％，高压高温灭菌后，将培养基温度降至36～37℃，再按1～3v/v％的接种量接种猪丹毒弱毒菌的二级种子，在36～37℃下培养20～24h，制得猪丹毒弱毒菌的发酵培养物；
[0014]其中，所述培养基为上述的猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基。
[0015]优选地，步骤S3中，在110～120℃下进行高压蒸汽灭菌40～50min。
[0016]优选地，步骤S3中，在pH值6.4～7.3条件下培养，优选6.7～7.0。
[0017]优选地，步骤S3中，所述猪丹毒弱毒菌的培养方法选用厌氧培养、静置培养(需氧静置培养法)、或静置厌氧培养。
[0018]本专利技术第三方面提供一种由上述的培养方法培养得到的发酵培养物在制备药物或者疫苗中的应用。该药物或者疫苗可用于预防由丹毒杆菌引起的相关疾病，如猪疣状心内膜炎、皮肤坏死、多发性非化脓性关节炎、皮肤疹块、败血症等。
[0019]优选地，所述发酵培养物经过再次培养后应用在制备药物或者疫苗中，再次培养方法为：将所述发酵培养物接种到培养基上，接种后6～8h调节pH值，10～12h加入葡萄糖无菌液，然后每2～3h调节一次pH值，当菌数达到最高峰时停止培养，收获发酵菌液，
[0020]其中，所述培养基为上述的猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基。
[0021]采用氨水将pH值调节至6.4～7.3，优选调节至6.7～7.0。
[0022]进一步优选地，将所述发酵菌液与冻干保护剂(6～8)：1的比例混合后进行冻干。
[0023]优选地，所述冻干保护剂为明胶和蔗糖的混合物，混合后，明胶的质量分数为1～2％，蔗糖的质量分数为4～6％。
[0024]冻干过程为：经过
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50℃预冻、
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5℃一次升华、解析升华三个阶段干燥，干燥结束进行压塞、放气后，完成冻干程序制成疫苗。其中，猪丹毒菌活菌数含量为每头份含活菌应不少于5.0
×
108CFU。
[0025]通过上述技术方案，本专利技术实现了以下有益效果：
[0026]1、本专利技术改进猪丹毒弱毒菌的培养基组成，所述培养基含有酵母浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠等商品化生物化学试剂，具有培养基组成成份获取方便，且其培养方法具有工艺简便、质量稳定、生产周期短、制造成本低等优点，尤其适用于猪丹毒弱毒菌G4T10的培养。此外，培养基的组分中没有有毒成分，相对于传统技术，不需要离心去除，不
容易造成污染，进而提升疫苗产品的质量。
[0027]2、本专利技术的猪丹毒弱毒菌培养基可在适宜环境下实现猪丹毒弱毒菌的高密度厌氧发酵培养，还利于促进猪丹毒弱毒菌高产活菌数，其活菌数可达到140～180
×
108CFU/ml，具有极好的产业应用价值。
[0028]3、本专利技术的发酵液经过配苗冻干后的成为弱毒活疫苗，可用于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基，其特征在于，按重量百分比计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉1.8～2.5wt％、牛肉浸粉1.8～2.5wt％、蛋白胨1.8～2.5wt％、大豆蛋白胨0.9～1.2wt％、葡萄糖0.5～1wt％、氯化钠0.1～0.3wt％、磷酸氢二钾0.2～0.5wt％、乙酸铵0.2～0.5wt％、磷酸氢二钠0.1～0.3wt％、蔗糖0.5～1wt％、蔗糖酯0.3～0.5wt％，余量水。2.根据权利要求1所述的猪丹毒弱毒菌G4T10的增菌培养基，其特征在于，按重量份计，该培养基包括如下组分：酵母浸粉2～2.3wt％、牛肉浸粉2～2.3wt％、蛋白胨2～2.3wt％、大豆蛋白胨1～1.1wt％、葡萄糖0.6～0.8wt％、氯化钠0.15～0.25wt％、磷酸氢二钾0.3～0.4wt％、乙酸铵0.3～0.4wt％、磷酸氢二钠0.15～0.25wt％、蔗糖0.6～0.8wt％、蔗糖酯0.35～0.45wt％，余量水。3.一种猪丹毒弱毒菌G4T10的培养方法，其特征在于，包括下述步骤：S1、将猪丹毒弱毒菌G4T10接种于血平板上，在36～37℃下培养18～22h，制得猪丹毒弱毒菌G4T10的一级种子；S2、将猪丹毒弱毒菌G4T10的一级种子单菌落接种于培养基中，在36～37℃下培养20～24h后，再按2～3v/v％接种于培养基中在36～37℃下培养20～24h；S3、在发酵罐中按照70～75v/v％加入培养基，以培养基体积计，消泡剂加入0.01～0.02v/v％，高压高温灭菌后，将培...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立新，谭爽，焦亮，余明生，陈武卫，
申请(专利权)人：国药集团扬州威克生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：