一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术适用于引物组技术领域，提供了一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，包括以下引物：外引物F3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；外引物B3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；内引物FIP的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；内引物BIP的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；环引物LF的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；环引物LB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示。该引物组大幅度提升了检测呼吸道病原微生物的时间，特异性良好，灵敏度高，稳定性良好，在重复性方面都可以得到良好的效果。良好的效果。良好的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于引物组
，尤其涉及一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)是人类呼吸道常见的一种致病病原菌，可引起社区获得性肺炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎、菌血症等疾病，其中由肺炎链球菌引起的脑膜炎、菌血症造成很高的死亡率，重症病人若不能及时检测用药，就极易威胁生命安全，然而，临床常规的生化指标分析无法对患者所感染的病原菌种做出准确鉴定，大多数临床治疗仍处于经验用药阶段，在使用高级抗生素方面存在较大的盲目性。目前临床上流行使用的相对比较科学地鉴定病原菌的方法主要是依靠细菌培养检测法，但是细菌培养检测法存在较大的缺陷：检测时间长(一般两天左右、某些特殊菌种需培养1
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2周)、准确率低(假阴性率和假阳性率都较高)、难以检测出难培养的病原体等。而且肺炎链球菌耐药现象越来越严重，给人类健康带来严重的威胁。肺炎链球菌的快速诊断是一个急需解决的问题。
[0003]Notomi等人在2000年开发出了一种新的核酸扩增技术，即环介导恒温扩增技术，环介导等温扩增法(loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的BstDNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。
[0004]LAMP技术具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在呼吸道病原微生物的快速检测方面的应用。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的在于提供一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，旨在解决上述
技术介绍
中存在的问题。
[0006]本专利技术实施例是这样实现的，一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，包括以下引物：
[0007]外引物F3：TGTTCCGTCTGGTTTGAGGT；
[0008]外引物B3：ACTGGTACTGGTTCGACAAC；
[0009]内引物FIP:
[0010]CGCTAAAGAAGGCGCCATGGTATACCAGCCTGTTCCGTCC；
[0011]内引物BIP:
[0012]CCTTGTACTTGACCCAGCCTGTCAGGCTGGAAGAAAATCGCT；
[0013]环引物LF:TCAAATGCCTTTATCCAGTCAGC；
[0014]环引物LB:CTTCATGGCACCTTCTTCGTT。
[0015]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种检测肺炎链球菌的试剂盒，包括上述LAMP
引物组。
[0016]作为本专利技术实施例的一种优选方案，所述试剂盒还包括：反应液、甜菜碱、阳性对照品、阴性对照品；
[0017]其中，所述反应液包括：Bst大片段DNA聚合酶，荧光染料Eva Green，dNTPs，Tris
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Hcl，KCl，MgSO4，(NH4)2SO4。
[0018]作为本专利技术实施例的一种优选方案，所述试剂盒中外引物F3、B3的使用浓度为10μM，所述内引物FIP、BIP的使用浓度为100μM，所述环引物LF、LB的使用浓度为10μM。
[0019]作为本专利技术实施例的一种优选方案，所述试剂盒中的阳性对照品为肺炎链球菌DNA，阴性对照品为1xTE缓冲液。
[0020]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种检测肺炎链球菌的方法，所述方法为采用上述LAMP引物组检测肺炎链球菌。
[0021]作为本专利技术实施例的一种优选方案，所述方法包括下列步骤：
[0022]A：提取待检样品中的核酸基因组作为环介导恒温扩增反应体系的模板；
[0023]B：将反应试剂加入进行环介导恒温扩增；
[0024]配置LAMP反应体系，每25μL体积的LAMP反应体系：环介导恒温反应液为10.5μL，甜菜碱为2μL，外引物F3、B3分别加入0.5μL、0.5μL；内引物FIP、BIP分别加入0.4μL、0.4μL；环状引物LF、LB各加入2μL；待检样品中提取的DNA模板加入2.2μL(阴性对照样本为1XTE缓冲液)；ddH2O加入4.5μL补足至25μL；
[0025]LAMP反应的条件为在63℃下恒温反应60min。
[0026]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述LAMP引物组在制备检测肺炎链球菌试剂中的用途。
[0027]本专利技术实施例提供的检测肺炎链球菌的LAMP引物组，大幅度提升了检测呼吸道病原微生物的时间，LAMP引物组包括环状引物LF、LB在内的F3、B3、FIP、BIP，该引物组可以用于检测肺炎链球菌，其特异性良好，该引物灵敏度高，稳定性良好，同时还在该LAMP引物组中引入环引物LF、LB，使反应出峰时间减少，应用该LAMP引物组建立的环介导等温扩增技术来检测呼吸道病原微生物的肺炎链球菌，在特异性、灵敏度和重复性方面都可以得到良好的效果。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例提供的检测肺炎链球菌的LAMP引物组的检测结果曲线图；
[0029]图2、图3均为本专利技术实施例提供的检测肺炎链球菌的LAMP引物组的灵敏度验证曲线图；
[0030]图4、图5均为本专利技术实施例提供的检测肺炎链球菌的LAMP引物组的特异性验证曲线图；
[0031]图6为本专利技术实施例提供的检测肺炎链球菌的LAMP引物组的重复性试验曲线图。
具体实施方式
[0032]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并
不用于限定本专利技术。
[0033]以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。
[0034]实施例1
[0035]本专利技术实施例提供了一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组以及性能分析
[0036]1.1、引物设计
[0037]LAMP引物组设计采用Primer Explorer V5软件进行设计，其网站为http://primerexplorer.jp/e/，将从NCBI数据库上下载好的肺炎链球菌自溶素基因LYTA的序列导入上述软件，经过筛选得到合适的引物，由上海生工生物工程股份有限公司进行引物合成，合成后的引物其初始浓度为100μM，其使用浓度分别为：外引物F3、B3分别为10μM；内引物FIP、BIP分别为100μM；环状引物LF、LB为10μM。取不同体积的引物进行混匀后进行肺炎链球菌的检测，经上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测肺炎链球菌的LAMP引物组，其特征在于，包括以下引物：外引物F3：TGTTCCGTCTGGTTTGAGGT；外引物B3：ACTGGTACTGGTTCGACAAC；内引物FIP:CGCTAAAGAAGGCGCCATGGTATACCAGCCTGTTCCGTCC；内引物BIP:CCTTGTACTTGACCCAGCCTGTCAGGCTGGAAGAAAATCGCT；环引物LF:TCAAATGCCTTTATCCAGTCAGC；环引物LB:CTTCATGGCACCTTCTTCGTT。2.一种检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的LAMP引物组。3.根据权利要求2所述的检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡江，张迅，徐浩淇，阮婧华，陈芳，邓丽，曾金兴，罗杰，周泽波，周庭波，
申请(专利权)人：贵州金玖生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：