一种烟叶中原花青素含量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种烟叶中原花青素含量的检测方法，该检测方法为可同时检测烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2，具体包括以下步骤：样品预处理，提取，净化和原花青素的检测。本发明专利技术通过快速、简单、可靠的提取方法对烟草样品中原花青素进行提取，通过加入Carbon分散吸附剂去除基质效应，采用高选择性、高灵敏度的超高效液相色谱法测定烟叶中原花青素的残留量；相比现有技术，本发明专利技术的检测方法具有样品处理简便、检测灵敏度和准确性更高的特点，能完全满足原花青素检测要求。求。

【技术实现步骤摘要】
一种烟叶中原花青素含量的检测方法


[0001]本专利技术涉及烟叶检测
，具体涉及一种烟叶中原花青素含量的检测方法。

技术介绍

[0002]原花青素是植物中一类重要的酚类次生代谢产物，具有较强的抗氧化性，在植物的生物及非生物胁迫反应过程中，可以有效地清除活性氧自由基，减少活性氧自由基对于组织细胞的伤害，提高植物的抗逆性。研究发现在烟草植株中过表达茶叶中原花青素合成途径相关基因(CsDFR,CsANR)，能够显著提高转基因烟草的原花青素含量，同时提高转基因烟草清除活性氧自由基的能力，以及提高烟草叶片抵御斜纹贪夜蛾的能力(Kumar et al.,2013)。
[0003]原花青素是由包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和没食子酸等单体，以及这些单体通过C4
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C6、C4
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C8键结合而成的低聚体和高聚体等组成的混合物。目前，常用的分析方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱－质谱法，但是这些分析方法测定茶叶中的原花青素都有较大的弊端，如紫外分光光度法只能测定原花青素的总成分，专属性不强；高效液相色谱法不能区分与原花青素结构类似的多酚类物质；由于烟叶基质较为复杂，高效液相色谱－质谱分析时存在基质干扰强，影响方法的准确性和灵敏度。目前，有关烟叶中原花青素的分析尚未见报道。
[0004]鉴于上述情况，有必要研究一种烟叶中原花青素含量的检测方法以解决上述技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种烟叶中原花青素含量的检测方法，旨在对烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2进行准确、高灵敏度的检测。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提出一种烟叶中原花青素含量的检测方法，所述检测方法为可同时检测烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2，具体包括以下步骤：
[0008]S1、样品预处理：将新鲜的烟叶样品放入研钵，加液氮研磨粉碎，将研磨好的样品转入冻干机进行冷冻干燥，得到待测样品，将待测样品置于冰箱保存待用；
[0009]S2、提取：称取步骤S1中的待测样品0.05g至离心管中，加入乙腈水溶液，超声提取20～30min后离心分离，得上清液；
[0010]S3、净化：移取步骤S2中的上清液至离心管中，加入分散吸附剂旋涡振荡2～5min，二次离心分离，得净化后的上清液；吸取净化后的上清液过0.22μm有机相滤膜后放入装有内插管的进样瓶中待检；
[0011]S4、原花青素的检测：利用超高效液相色谱
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串联质谱法检测步骤S3中的待检样品。
[0012]优选地，所述步骤S4中利用超高效液相色谱
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串联质谱检测时，所述超高效液相色
谱的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(10mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；进样量：2μL；流速：0.35mL/min，流动相A：0.2％乙酸甲醇，流动相B：0.2％乙酸水，梯度洗脱：0～1min，5％A；1～3min，5％～25％A；3～5min：25％A；5～9min:25％～80％A；9～11min：80％A；11～11.1min:5％A；11.1～13min：5％A；
[0013]所述质谱检测的分析条件为：离子源：ESI；扫描方式：负离子模式；气帘气压力：40psi；雾化气压力：60psi；辅助气压力：50psi；离子源温度：600℃；喷雾电压：
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4000V，采用多反应监测MRM模式。
[0014]优选地，所述质谱检测的参数为：
[0015][0016]优选地，所述步骤S4中利用超高效液相色谱
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串联质谱法进行检测时，标准溶液的配制为：称取儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2标准品至棕色容量瓶中，溶解后定容，用乙腈配制成1mg/mL的标准储备液，于
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15～
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25℃冰箱中避光保存待用。
[0017]优选地，所述步骤S1中冰箱温度为4℃。
[0018]优选地，所述步骤S2中的乙腈为80％的乙腈，加入量为1mL；所述离心分离为以5000～6000r/min离心3～5min。
[0019]优选地，所述步骤S3中的二次离心分离为以5000～6000r/min离心分离3～5min。
[0020]优选地，所述步骤S3中的移取的上清液为0.5～1.5mL，所述分散吸附剂为Carbon分散吸附剂，加入量为25～100mg；所述内插管为250μL。
[0021]综上所述，相比于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0022]1、本专利技术采用快速、简单、可靠的提取方法对烟草样品中原花青素进行提取，通过加入Carbon分散吸附剂去除基质效应，采用高选择性、高灵敏度的超高效液相色谱法测定烟叶中原花青素的残留量；相比现有技术，本专利技术的检测方法具有样品处理简便、检测灵敏度和准确性更高的特点，能完全满足原花青素检测要求。
[0023]2、本专利技术的检测方法简单易行，样品的提取步骤高效、安全、成本低，样品的净化步骤简单快速，净化效果及回收率高，通过在检测过程中对样品处理方法进行优化以及检测中色谱条件的控制，实现了烟草中原花青素的准确、高灵敏度检测。
[0024]3、本专利技术的检测方法对烟叶中原花青素的单体和聚体分离效果好，采用多反应监测扫描，具有高选择性和高灵敏度，适用于烟叶中原花青素的准确检测。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的标准曲线图，其中a图为儿茶素、b图为表儿茶素、c图原花青素B1和d图为原花青素B2；
[0026]图2为本专利技术4种原花青素标准品的总离子流图，其中1为原花青素B1、2为儿茶素、
3为原花青素B2、4为表儿茶素；
[0027]图3为本专利技术烟叶样品中4种原花青素的总离子流图，其中1为原花青素B1、2为儿茶素、3为原花青素B2、4为表儿茶素；
[0028]图4为本专利技术添加不同Carbon分散吸附剂的净化效果图。
具体实施方式
[0029]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本专利技术及其应用或使用的任何限制。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围
[0030]对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。此外，下面所描述的本专利技术不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
[0031]本具体实施方式提供的一种烟叶中原花青素含量的检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟叶中原花青素含量的检测方法，其特征在于，所述检测方法为可同时检测烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素B1和原花青素B2，具体包括以下步骤：S1、样品预处理：将新鲜的烟叶样品放入研钵，加液氮研磨粉碎，将研磨好的样品转入冻干机进行冷冻干燥，得到待测样品，将待测样品置于冰箱保存待用；S2、提取：称取步骤S1中的待测样品0.05g至离心管中，加入乙腈水溶液，超声提取20～30min后离心分离，得上清液；S3、净化：移取步骤S2中的上清液至离心管中，加入分散吸附剂旋涡振荡2～5min，二次离心分离，得净化后的上清液；吸取净化后的上清液过0.22μm有机相滤膜后放入装有内插管的进样瓶中待检；S4、原花青素的检测：利用超高效液相色谱
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串联质谱法检测步骤S3中的待检样品。2.根据权利要求1所述的烟叶中原花青素含量的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中利用超高效液相色谱
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串联质谱检测时，所述超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(10mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；进样量：2μL；流速：0.35mL/min，流动相A：0.2％乙酸甲醇，流动相B：0.2％乙酸水，梯度洗脱：0～1min，5％A；1～3min，5％～25％A；3～5min：25％A；5～9min:25％～80％A；9～11min：80％A；11～11.1min:5％A；11.1～13min：5％A；所述质谱检测的检测条件为：离子...

【专利技术属性】
技术研发人员：师君丽，李勇，逄涛，赵璐，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：