评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及甘油、甘油

【技术实现步骤摘要】
评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸在制备用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂或试剂盒和检测方法的新应用，属于分析化学、环境化学、药物化学、生物化学领域。
技术背景
[0002]抗生素作为杀菌剂、生长和(或)质量促进剂，被广泛使用于人、动物、农业和养殖业，并且，其使用量还在快速增长。抗生素的使用使得其原型物及其代谢物被大量地排放到环境中，尤其是水环境，例如：地表水、地下水、海水、污水及沉积物。微生物对抗生素产生耐药是抗生素使用及其在环境蓄积的严重后果之一，并已威胁到人和生态系统的健康。值得关注的是，微生物抗生素耐药广泛存在于人和环境中，并且由于微生物种类繁多、传代时间短等特点，微生物耐药易于传播。因而，微生物耐药机理研究具有紧迫性。
[0003]众多研究表明，代谢重编程可调控抗生素药效。基于气相色谱
‑
质谱技术的代谢组学发现，葡萄糖和丙氨酸在卡那霉素耐药的迟缓爱德华氏菌中降低。随后的机理研究表明，外源葡萄糖和(或)丙氨酸以乙酰辅酶A形式进入三羧酸循环，并激活该通路中的代谢酶，以用于相关代谢物合成；此外，用三羧酸循环代谢物激活该通路，促进还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和质子动力形成及抗生素摄取，从而恢复抗生素耐药菌对抗生素的敏感性。研究表明，在压力诱导的抗生素耐受条件下(如：缺氧，低pH、铁限制、感染)，甘油三酯在结核杆菌及相关的环境细菌中蓄积。敲除tgs1基因，过表达citA基因和
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C标记乙酸示踪实验表明，甘油三酯合成可从三羧酸循环及其它促生长的通路中夺走碳源，从而抑制细菌生长及抗生素药效；而扰乱上述代谢转换则无法抑制压力条件下的细菌生长，并可在感染条件下，使细菌重新对抗生素敏感。此外，激活糖酵解及能产生活性氧的通路(如：呼吸链)、核苷酸氧化、抑制糖异生、补充一些外源氨基酸(如：甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸和丙氨酸)均可提高抗生素药效。以上数据表明，重编程代谢是提高抗生素药效的有效方式。
[0004]细菌可通过基因突变、抗性基因的表达和转移、和(或)表型适应获得抗生素耐药效应，该效应会诱发代谢紊乱，进而降低相关生理效率。然而，细菌补偿、减小甚至消除抗生素耐药相关代谢负荷的能力很强，从而使得耐药菌能保持稳定并存活。研究细菌如何获得抗生素耐药，发现可用于诊断细菌是否产生抗生素耐药的潜在标志物，将有利于更有效地使用抗生素，预防并减少抗生素及其耐药带来的人及生态系统健康危害。
[0005]油酸和棕榈油酸是生物体内主要的游离脂肪酸，并且是其它大分子脂质的主要组成成分。甘油和甘油
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磷酸可为甘油酯、磷脂等大分子脂质合成提供甘油骨架，并可进入三羧酸循环，进一步转化成其它代谢物(如：有机酸、氨基酸)。目前尚未发现将甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和(或)油酸用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的报道。常用的光谱技术基于特征官能团的光谱信号检测化合物，因而，基于光谱技术的试剂盒方法，通常检测的是具有相同官能团化合物混合物，无法分辨具有相同官能团的化合物，如：同系物、官能团位置异构体、顺反异构体。因而，无法区分棕榈油酸、油酸与其它脂肪酸。众所周知，色
谱
‑
质谱技术对化合物的分辨率远高于光谱技术。气相色谱
‑
质谱技术能准确区分脂肪酸的碳链长度、不饱和碳键的位置、数量和顺反异构，其在脂肪酸不饱和键位置和顺反异构体的区分上，强于液相色谱
‑
质谱技术。此外，由于甘油与甘油
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磷酸具有强极性，在常用的反相液相色谱柱上保留弱，与其它强极性代谢物和溶剂在死时间附近流出，因而在反相液相色谱
‑
质谱检测上通常会出现峰形差、离子抑制效应强等效应，从而影响定性与定量结果。然而，甘油与甘油
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磷酸经衍生化后，可在毛细管柱上得到很好的保留，从而在质谱上得到有效的检测。其次，气相色谱
‑
质谱采集的数据经由ChromaTOF(LECO Cor.,USA)软件进行重叠峰去卷积后，可消除目标代谢物的干扰信号，并提取目标代谢物的特征离子，从而实现代谢物高灵敏、高特异性的定性和定量分析。
[0006]基于当前的研究现状及技术特点，本专利技术采用气相色谱
‑
质谱技术检测甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸，该方法具有易于操作、高灵敏度、特异性和稳定性的特点。本专利技术采集庆大霉素敏感和耐药的大肠杆菌代谢轮廓后，筛选出甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中任一种或一种以上代谢物作为标志物，实现在制备用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂盒及其检测的新用途，筛选出的标志物具有优良诊断灵敏度和特异性。目前尚未发现将甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和(或)油酸用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的报道。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的是针对当前脂肪酸和强极性代谢物检测存在的低灵敏度、低特异性等问题，提供一种小分子代谢物试剂盒在评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的应用，亦提供了可同时检测上述小分子代谢物的方法，实现了非极性和强极性代谢物的同时检测。
[0008]甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和(或)油酸在制备用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂或试剂盒中的应用。
[0009]所述的试剂或试剂盒用于检测细菌中甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸的含量。
[0010]所述的试剂或试剂盒为采用气相色谱
‑
质谱技术检测细菌中甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸含量的试剂的组合。
[0011]一种用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂或试剂盒，包括：
[0012]①
标准品：甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和油酸，所述标准品分别用于细菌中甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和油酸的定性；
[0013]②
80
‑
100％(v/v)甲醇/水提取液：所述提取液用于提取细菌代谢物；
[0014]③
衍生化试剂：甲氧胺吡啶溶液(10
‑
20mg/mL)、N
‑
甲基
‑
N
‑
(三甲基硅基)三氟乙酰胺。
[0015]细菌为革兰氏阴性菌。
[0016]氨基糖苷类抗生素包括：链霉素，庆大霉素，妥布霉素，奈替米星，阿米卡星，等。
[0017]为实现上述目的，本专利技术以大肠杆菌为模型，以庆大霉素为例，采用如下技术方案：
[0018]1.庆大霉素耐药大肠杆菌筛选：用庆大霉素连续处理大肠杆菌，直至产生耐药效应(其最小抑制浓度MIC值为对照的4倍及以上)后，保存于
‑
80℃冰箱中备用。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.代谢物在制备用于评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应的试剂或试剂盒中的应用或者代谢物在评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应中的应用，其中所述代谢物指甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中的任一种或二种以上代谢物或其组合。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢物用于检测细菌中甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸的含量。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒为采用气相色谱
‑
质谱方法检测细菌中甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和油酸含量的试剂的组合；包括：
①
标准品：甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中的一种或二种以上代谢物或其组合，所述标准品分别用于细菌中甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和油酸中的任一种或二种以上的定性；
②
提取液：甲醇/水溶液(80
‑
100％，v/v)，所述提取液用于提取细菌代谢物；
③
衍生化试剂：甲氧胺吡啶溶液(10
‑
20mg/mL)、N
‑
甲基
‑
N
‑
(三甲基硅基)三氟乙酰胺。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，细菌中甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸含量的检测过程，包括以下步骤：
①
分别培养并收集经和未经氨基糖苷类抗生素处理的两组细菌样本后，分别用提取液提取代谢物；
②
细菌代谢物提取物经冷冻浓缩干燥后，分别进行衍生化反应；
③
采用气相色谱
‑
质谱方法分别检测细菌中甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中的一种或二种以上的含量；
④
基于甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中的任一种或二种以上代谢物含量，建立判别模型，评价细菌氨基糖苷类抗生素耐药效应，若处理后的细菌中甘油、甘油
‑3‑
磷酸、棕榈油酸和油酸中的一种或二种以上的含量大于未经处理的细菌中相对应的甘油、甘油
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磷酸、棕榈油酸和油酸中的一种或二种以上的含量，则可认定处理后的细菌为耐药菌，否则为非耐药菌。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的气相色谱条件：进样量1μL，进样...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶国注，黄乾生，苏玉斌，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：