油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用制造技术

本发明专利技术公开了油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，属于生物技术领域。所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。所述应用包括：(1)利用多基因组装技术依次将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；(2)利用转基因技术将目标基因片段导入受体植株中，获得生物自发光强度增强的转基因植株。本发明专利技术首次公开BnC3H基因与参与植物自发光的Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因共同表达，可以显著提升植物的生物自发光强度。本发明专利技术为可持续发光植物的育种和生产提供了一个可行的技术方案。和生产提供了一个可行的技术方案。和生产提供了一个可行的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用。

技术介绍

[0002]生物发光是一种自然现象，可以在800个属约10000个物种中观测到。能够自然发光的生物包括细菌、真菌、藻类、无脊椎动物和昆虫等，以海生生物为多(Haddock et al,2010)。大多数情况下，生物发光的功能在于传达视觉信号，用以警示掠食者、吸引猎物或者求偶。进一步科学研究后，还有望研发出自发光“树灯”来代替路灯照亮道路，以起到减少城市道路照明耗电量、节约能源的作用。
[0003]有关自发光植物的研究，已有相关报道。2013年，斯坦福大学的合成生物学家与植物学家就提出了“可持续发光植物”的商业开发项目，将荧光素酶基因导入到拟南芥基因组中；2014年，研究报道将海洋发光细菌发光基因插入烟草叶绿体DNA中，成功培育出了世界上第一株发光植物(Fleiss and Sarkisyan,2019)。但这些项目目前都没有取得根本性突破，尚未投入生产。
[0004]长期以来，人们推测真菌生物发光系统(Elucidation of the Fungal Bioluminescent Pathway，FBP)至少由四种成分组成：分子氧、荧光素、依赖于NAD(P)H的羟化酶和荧光素酶。2015年，Purtov等证明FBP中荧光素的化学成分是3
‑
羟基组氨酸(Purtov et al,2015)。2017年，Kaskova等阐明了真菌氧化荧光素的结构(Kaskova et al,2017)。2018年，Kotlobay等鉴定了FBP中的真菌荧光素酶及其他三种关键酶，阐明了真菌荧光素的生物合成循环以及发光机制(Kotlobay et al,2018)。这是第一个来自真核生物的可编码发光系统，也被认为是目前发光植物构建的核心代谢循环。
[0005]将FBP应用于植物的关键是原料咖啡酸。咖啡酸是生产木质素和其他关键植物代谢物的关键中间体，广泛存在于植物中(Deng and Lu,2017),咖啡酸循环在外源真核生物毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功表达。相对简单的系统、易得的底物和已有的实践为咖啡酸循环应用于植物奠定了基础。
[0006]Khakhar A等将构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组中的NPGA(4
’‑
phosphopantetheinyl transferase)基因、光茸菌(Neonothopanus nambi)基因组中的H3H(hispidin
‑3‑
hydroxylase)基因和Hisps(Hispidin synthase)基因，以及真菌荧光素酶(Luz)基因整合到Moclo质粒中(Engler et al,2014)，再将质粒导入根瘤农杆菌(A.tumefaciens)中，并与经过预处理的茎外植体进行混合培养，以将生物自发光元件整合入植株基因组中。从而使植株体内来自苯丙氨酸生物合成途径的咖啡酸(caffeic acid)经Hisps蛋白酶(Hispidin synthase)激活后转化为牛奶树碱(Hispidin)。牛奶树碱经牛奶树碱3
‑
羟基化酶(hispidin
‑3‑
hydroxylase，H3H)催化产生3
‑
羟基牛奶树碱(3
‑
hydroxyhispidin)。荧光素酶(Luz)会将3
‑
羟基牛奶树碱氧化成荧光素3
‑
羟基牛奶树碱。而荧光素3
‑
羟基牛奶树碱在释放能量变成咖啡酰丙酮酸(caffeylpyruvic acid)的过程中会
释放出波长在520nm的可见光。随后，CPH(Caffey pyruvate hydrolase)编码的蛋白酶将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而实现植物自发光循环，使植物持续产生光(Khakhar et al,2020；Mitiouchkina et al,2020)。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种能够提升植物生物自发光强度的基因，将其应用到可持续发光植物的选育当中。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术提供了油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。
[0010]本专利技术研究发现，相较于由Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因整合入植株基因组中获得的自发光植株，进一步整合油菜BnC3H基因可以显著提高植物自发光强度。
[0011]BnC3H基因来源于油菜基因组，编码p
‑
香豆酸3
‑
羟化酶(p
‑
coumaric acid 3
‑
hydroxylase)。该基因的CDS序列全长1527bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]BnC3H基因编码的蛋白质酶由508个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013]进一步的，所述应用包括以下步骤：
[0014](1)利用多基因组装技术将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和所述BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；
[0015](2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株中，培育，获得生物自发光强度增强的转基因植株。
[0016]所述Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因编码的蛋白酶在植物体内参与咖啡酸循环，实现植物自发光。
[0017]进一步的，Hisps基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，所述CPH基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述H3H基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述NPGA基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Luz基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。
[0018]进一步的，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。具体的，所述35S启动子为CaMV 35S启动子。
[0019]进一步的，步骤(1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。所述TransGene Stacking II系统为多基因组装载体系统，参见申请号为2017103841977的中国专利。
[0020]进一步的，以pYL322d1作为供体载体Ⅰ，pYL322d2作为供体载体Ⅱ，pYLTAC380GW作为受体载体。
[0021]具体的，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：
[0022]1)将Hisps基因片段、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.油菜BnC3H基因在提高植物生物自发光强度中的应用，其特征在于，所述BnC3H基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述BnC3H基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：(1)利用多基因组装技术将Hisps基因、CPH基因、H3H基因、NPGA基因、Luz基因和所述BnC3H基因整合到受体载体中，构建获得多基因载体；(2)利用转基因技术将多基因载体中的目标基因片段导入受体植株中，培育，获得生物自发光强度增强的转基因植株。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述Hisps基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示，所述CPH基因的编码序列如SEQ ID NO.4所示，所述H3H基因的编码序列如SEQ ID NO.5所示，所述NPGA基因的编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述Luz基因的编码序列如SEQ ID NO.7所示。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述多基因载体中各目的基因的上游均含有35S启动子序列。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，采用TransGene Stacking II系统进行多基因组装。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：步骤(1)中，所述多基因载体的构建方法包括以下步骤：1)将Hisps基因片段、H3H基因片段、Luz基因片段分别插入供体载体pYL322d1的多克隆位点中获得供体载体pYL322d1
‑
Hisps，pYL322d1
‑
H3H，pYL322d1
‑
Luz；将CPH基因片段、NPGA基因片段和BnC3H基因片段分别插入供体载体pYL322d2的多克隆位点中获得供体载体pYL322d2
‑
CPH，pYL322d2
‑
NPGA，pYL322d2
‑
BnC...

【专利技术属性】
技术研发人员：都浩，钟静玲，葛杰瑜，郑鹏，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：