LDHA在心脏成纤维细胞中的应用制造技术

本发明专利技术属于细胞工程和基因工程技术领域，涉及LDHA在心脏成纤维细胞中的应用。所述LDHA的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1。成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本发明专利技术第一次证实LDHA在心脏成纤维细胞中参与影响以上进程。因此，本发明专利技术提出了心肌纤维化治疗的新靶点，对于心肌纤维化在生物基因手段方面的诊断和防治提供了新的思路和方法。治提供了新的思路和方法。治提供了新的思路和方法。

【技术实现步骤摘要】
LDHA在心脏成纤维细胞中的应用


[0001]本专利技术属于细胞工程和基因工程
，涉及LDHA在心脏成纤维细胞中的应用。

技术介绍

[0002]纤维化的广义的定义为细胞外基质的积累，纤维化可以分为修复性纤维化和反应性纤维化。心肌梗死后的组织修复即为替代性心肌纤维化即修复性心肌纤维化；而非缺血性心肌病导致的细胞外基质积累及代谢过程的改变即为反应性心肌纤维化。心肌梗死后形成的替代性心肌纤维化中，交联型胶原纤维的沉积形成瘢痕为心脏提供强有力的结构支撑，而在高血压心脏病，糖尿病心脏病，肥厚性心脏病等长期适应不良信号时所导致的反应性纤维化，表现为血管周围和间质的纤维化。心肌纤维化虽然能在细胞丢失时提供结构性支撑，但心肌纤维化引起的心肌结构改变，会导致心功能障碍的进一步发展，诱发心率失常，也会使心衰患者的病情恶化。成纤维化细胞分化为肌成纤维细胞后，细胞外基质大量沉积，在梗死处形成瘢痕，维持心脏的稳定结构。而在间质性纤维化中，纤维化的激活在没有心肌细胞死亡的情况下即可以发生，成纤维细胞激活转化为肌成纤维细胞后α
‑
SMA表达增加，细胞外基质弥漫性的沉积在心肌间质中，影响心脏的舒张功能。
[0003]心肌纤维化是指在各种病理因素的刺激下，心脏中的成纤维细胞过度增殖，并且转化为α
‑
SMA阳性的肌成纤维细胞。肌成纤维细胞是细胞外基质的主要来源，细胞外基质的主要成分是I型胶原蛋白和III型胶原蛋白。细胞外基质的过度沉积会改变心脏原有的正常结构，发生心肌重塑。心肌纤维化是多种心脏疾病的终末期表现，导致心肌僵硬度增加、心腔扩大、收缩和舒张功能障碍。心肌重塑导致心房颤动、恶性心律失常、心力衰竭甚至心源性猝死等恶性心血管事件的发生。
[0004]乳酸脱氢酶(LDHA)是一种通过将丙酮酸和NADH转化为乳酸来催化沃伯格效应最后一步的酶。在肿瘤中，有助于上皮
‑
间质转化(EMT)和转移。据报道，在许多类型的肿瘤中都存在上调的LDHA与不良预后相关。LDHA减少显著抑制细胞转化，显著延迟肿瘤形成。有研究表明LDHA与NADH结合，通过稳定软骨细胞中关键的促炎介质IκB
‑
ζ，促进活性氧(ROS)诱导分解代谢变化。而ROS的增加于心肌纤维化及心肌肥厚作用相关，LDHA在心脏中的作用尚无进一步的研究。
[0005]自噬是真核生物细胞内特有的一种高度保守的代谢过程，主要指溶酶体对细胞内结构(细胞器、长寿命蛋白质或核酸等生物大分子)进行降解，为细胞重建、再生、修复提供原材料，从而实现细胞的再循环及再利用。自噬的主要作用是清除、降解细胞内受损的细胞结构、衰老的细胞器和不再需要的大分子等，并选择性的移除受损的线粒体。因此，自噬与细胞的生长、发育及细胞稳态的平衡的维持密不可分。自噬有助于细胞产物的合成以及维持代谢的平衡，是细胞在缺乏营养的状态下获取能量的主要机制。自噬在心肌细胞中起着重要作用，主要原因包括：
①
心肌细胞是一种长寿命的分裂后期细胞，分化、再生能力几乎没有，因此在心肌细胞中自噬对于维持心脏功能和活力具有重要的作用。
②
如前文所述，自
噬可以选择性清除受损的线粒体，心肌细胞富含线粒体，故自噬对心肌病理生理状态具有重要意义，具有心肌保护作用。
③
心脏疾病患者中，心肌细胞凋亡水平很低，心脏疾病患者心肌细胞的死亡与Ⅱ型程序性细胞死亡一自噬性细胞死亡有关。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对传统心肌纤维化研究过程中存在的问题提出LDHA基因作为靶点在制备抗心肌纤维化药物中的应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：尼古丁诱导心肌纤维化，并以浓度依赖的方式加剧心肌纤维化的发生。本专利技术提出LDHA蛋白在尼古丁诱导心肌纤维化的过程中发挥作用。
[0008]本专利技术提出通过基因工程技术改变LDHA基因在成纤维细胞的表达量，能够影响成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化，所述LDHA基因的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1。
[0009]本专利技术的同时提供抑制LDHA基因的siRNA，序列如下：si
‑
r
‑
LDHA_001 ：5
’‑
GCTTGTGCCATCAGTATCT
‑3’
；si
‑
r
‑
LDHA_002 ：5
’‑
GGGAGAGATGATGGATCTT
‑3’
；si
‑
r
‑
LDHA_003 ：5
’‑
TCCCATTTCCACCATGATT
‑3’
。
[0010]在心脏成纤维细胞中补充抑制LDHA基因的siRNA片段后，能够抑制心肌成纤维细胞的增殖与分化，抑制胶原蛋白沉积，起到抗纤维化的作用。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本专利技术第一次提出并证实LDHA在心脏成纤维细胞中参与影响以上进程。因此，本专利技术提出了心肌纤维化治疗的新靶点，对于心肌纤维化在生物基因手段方面的诊断和防治提供了新的思路和方法。
附图说明
[0012]图1为DARTS实验结果。
[0013]图2 为qRT
‑
PCR检测siRNA对于LDHA的敲除效率结果。
[0014]图3为敲低LDHA对尼古丁诱导的细胞增殖活力影响结果。
[0015]图4 为Western blot检测敲低LDHA及尼古丁刺激对于心脏成纤维细胞活化指标α
‑
SMA和增殖细胞核抗原PCNA的影响结果。
[0016]图5 为Western blot检测敲低LDHA对于自噬的影响。
[0017]图6为LDHA的抑制剂FX11预处理后，Western blot检测成纤维细胞增殖和活化相关指标PCNA和α
‑
SMA的表达情况。
[0018]图7为Western blot检测LDHA的抑制剂FX11对尼古丁引起的自噬阻断的影响。
具体实施方式
[0019]为了能够更清楚地理解本专利技术的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特
征可以相互组合。
[0020]在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是，本专利技术还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本专利技术并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0021]实施例11.材料准备。
[0022](1)实验前准备：将培养瓶采用紫外消毒30 min。
[0023](2)取乳鼠的心脏，剪成1
‑
3 mm3的小碎块，II型胶原酶进行消化3次，在培养瓶中进行差速贴壁1.5小时，以去除心肌细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LDHA基因作为靶点在调控尼古丁诱导的心脏成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化进程中的应用，所述LDHA基因的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述调控方式为加入LDHA基因的抑制剂。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，调控方式为引入抑制LDHA基因siRNA，其特征在于，所述siRNA序列如下：si
‑
r
‑
LDHA_001：5
’‑
GCTTGTGCCATCAGTATCT
‑3’
；si
‑
r
‑
LDHA_002：5
’‑
GGGAGAGATGATGGATCTT
‑3’
；si
‑
r
‑
LDHA_003：5
’‑
TCCCATTTCCACCATGATT
‑3’
。4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，采用qRT
‑
PCR检测调控进程中LDHA基因的表达水平，qRT
‑
PCR检测中使用的引物序列如下：β
‑
actin：正向5
’‑
CGTTGACATCCGTAAAGACC
‑3’
，反向5
’‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏国海，李莹，吴会会，郑燕，李悦妍，陈嘉敏，
申请(专利权)人：济南市中心医院，
类型：发明
国别省市：